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多肽合成中的常见问题值得了解 [复制链接]

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刘军连 https://wapyyk.39.net/doctor/694482_comments.html

1、肽合成的基本原理?

固相肽合成是肽合成化学的重要突破。其主要特点是无需纯化中间产物,合成过程可以连续进行,为多肽合成的自动化奠定了基础。目前多肽的全自动合成基本上是固相合成。基本流程如下,

基于Fmoc化学合成,将目标肽C端氨基酸的羧基与不溶性聚合物树脂共价连接,然后以该氨基酸的氨基为起始点合成肽,形成肽与其他氨基酸的活化羧基结合。重复此过程即可获得肽。根据肽的氨基酸组成不同,肽的后处理方法不同,纯化方法也不同。

2、生产肽的常用方法有哪些?

线性肽的肽链采用Fmoc固相合成法延长,氨基酸从C端到N端逐步连接。开始时,第一个氨基酸通过酸敏感接头连接到不溶性支持树脂上。用六氢吡啶除去Fmoc保护基后,连接第二个Fmoc保护的氨基酸。连接方式包括预激活或“一锅”等。连接目标序列后,用TFA将肽链从树脂上洗脱下来,得到粗品。

3、不同实验如何选择肽的纯度?

肽的纯度是一个很重要的指标,纯度的选择取决于实验的目的。对于敏感性较低的筛选试验,建议使用粗品或75%,对于免疫水平,建议使用85%。对于受体-配体相互作用研究、生物测定或细胞水平研究,推荐值95%,对于结构研究,推荐值98%。

4、什么是肽的净含量(肽含量),它的意义是什么?

干肽的重量不仅含有肽,还含有一些非肽成分,如水、吸收的溶剂、配位离子和盐。肽的净含量是指其中肽的重量百分比。该百分比的值可以在50%到90%的范围内,具体取决于纯度、序列以及合成和纯化。不要将肽的净含量与肽的纯度混淆。它们是两个完全不同的概念。纯度通常由HPLC测定。纯度定义为肽样品中序列正确的组分的百分比,而肽的净含量是指样品中肽物质相对于非肽物质的百分比。肽的净含量通常通过氨基酸组成分析或紫外分光光度法测定。在某些对肽浓度敏感的实验中,该信息对于计算肽浓度非常重要。

5、如果肽纯度为95%,剩下的5%是多少?

肽的纯度通常由HPLC测定,标准乙腈梯度为每分钟1%。在合成过程中,氨基酸之间的交联效率并不总是达到%,从而产生了一系列氨基酸缺失杂质。这些氨基酸缺陷杂质大部分在纯化过程中被去除,但其色谱性能与目标肽非常相似。这些氨基酸缺失在剩余的百分之几中保留在肽样品中。

6、非HPLC纯化肽中存在哪些杂质?

粗品级和脱盐级中的肽和非肽杂质:如非全长肽和一些肽后处理原料如DTT、TFA等。

7、多长的肽段合适?

肽合成需要考虑肽的长度、电荷和疏水性等因素。长度越长,粗品的纯度和收率越低,提纯难度越大,合成失败的概率越大。当然,多肽功能区的序列是不能改变的,但为了多肽的顺利合成,有时需要在功能区的上下游添加一些辅助氨基酸,以提高多肽的溶解度和亲水性.如果肽段太短,合成可能会出现问题。主要问题是合成的肽在后处理过程中存在一定的难度。5肽以下的肽一般需要疏水性氨基酸,否则后处理比较困难。

8、如何从肽序列中确定肽的溶解度?

如果肽中含有高比例的疏水性氨基酸,如Leu、Val、IIe、Met、Phe和Trp,则很难溶解在水溶液中或根本无法溶解。这些氨基酸,无论是纯化的还是合成的,可能有问题。

一般疏水氨基酸比例50%,连续5个氨基酸不能疏水,带电荷氨基酸比例(正电荷K、R、H、N端,负电荷D、E、C端)达到20%,在肽N或C中,如果可以增加极性氨基酸,也可以提高溶解度。

9、为什么合成含有Cys、Met或Trp的肽很困难?

合成含有Cys、Met或Trp的肽并获得高纯度产品是困难的。主要原因是这些基团不稳定,容易氧化。应特别注意这些肽的使用和储存,避免重复打开盖子。

10、为什么某些肽的合成收率或纯度较低?

肽合成和引物合成有比较大的区别。不能合成的引物很少,但往往有不能合成的肽。由于Val、Lle、Tyr、Phe、Trp、Leu、Gln、Thr是直系同源或重复的氨基酸,在合成过程中肽链不能完全溶解,合成效率降低。在以下情况下,产品的合成效率和纯度都比较低,如:重复pro、Ser-Ser、重复ASP、四连续Gly等。

11、如何纯化肽?

通过反相柱(如C8、C18等)在nm处纯化肽。缓冲系统通常是含有TFA(pH值为2.0)的溶剂。缓冲液A在ddH2中含有0.1%TFAO,缓冲液B含有1%TFA/ACN/ph2.0。BufferA用于在纯化前溶解肽;如果溶液不好,用BufferB溶解,再用BufferA稀释。对于强疏水性肽,有时需要添加少量甲酸或乙酸。多肽粗品的HPLC分析,如果多肽不长(15aa以下),一般会有一个主峰,主峰通常是全长产物;对于20aa以上的长肽,如果没有主峰,HPLC需要匹配质量确定分子量,然后确定哪个峰是要合成的肽。

12、适合免疫的肽多长时间?

一般约为10-15个氨基酸。当然氨基酸数量越多,免疫效果越好,但合成费用也会增加。然后预计映射肽的长度将超过15个氨基酸。此外,10个氨基酸以下的肽在免疫方面的效果较差。

13、肽的外观是什么?

肽是粉末状的,通常是白色的。肽粉的颜色随着成分的不同而不同,比如一些带有FITC修饰的黄绿色。

14、如何溶解多肽?

溶解多肽非常复杂,通常很难一次确定合适的溶剂。一般是先取一点进行试验,不要完全溶解后再确定合适的溶剂。

以下方法可帮助您选择合适的溶剂:

确定肽的比电荷,将酸性氨基酸ASP(D)、Glu(E)和C端COOH设置为-1;碱性氨基酸Lys(K)、Arg(R)、His(H)和N端NH2为+1,其他氨基酸的电荷为0。计算电荷数。

如果净电荷数0,则肽呈碱性,用水溶解:如果不溶或不太溶,加入乙酸(10%以上);如果肽尚不溶解,则加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入ul水稀释。

若净电荷数0,肽呈酸性,溶于水;如果不溶解或不太溶解,加入氨水(25ul)溶解,然后加入ul水稀释。

如果净电荷数=0,肽是中性的,一般需要用乙腈、甲醇或异丙醇、DMSO等有机溶剂溶解。也有人提出需要尿素来溶解疏水性强的肽.

15、如何储存合成肽?

多肽长期保存一般需要避光保存,短期保存应在–20℃和4℃保存。肽可以在室温下短时间运输。肽在-20℃下是稳定的,尤其是冷冻干燥并储存在干燥器中。冷冻干燥的肽在暴露于空气之前可以在室温下储存。这将减少湿度的影响。当无法进行冻干时,最好的方法是少量储存样品。

对于含有Cys、Met或Trp的肽,脱氧缓冲液对于它们的溶解是必不可少的,因为这些肽很容易被空气氧化。在封端之前缓慢流过肽的氮气或氩气也可以减少氧化。含有Gln或Asn的肽也很容易降解,与没有这些问题和简单肽的肽相比,所有这些肽的寿命有限。

16、如何处理肽的两端?它是免费的还是受保护的?

肽用于模拟蛋白质。为了模拟蛋白质的表达,我们需要合成与蛋白质具有相似结构和电荷的肽。当一个肽从蛋白质中“切出”时,两端的电荷数将与基因体蛋白的电荷数不同。我们需要改变合成策略以使它们保持一致。一般来说,如果来自蛋白质的C端,N端被乙酰化屏蔽;如果它来自蛋白质的N端,则C端被酰胺化屏蔽;如果它来自蛋白质的中间部分,则两端被乙酰化和酰胺化屏蔽。

17、什么是电喷雾电离质谱(electrosprayionization,EIS)?

EIS可以产生多价离子化的蛋白质或多肽,可以分析相对分子量为1×的蛋白质,分辨率为1-amu。准确率约为0.01%。EIS更适用于高分子量蛋白质的在线分析,需要气化或有机溶剂对样品进行敏化。

18、什么是基质辅助激光解离/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)?

MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中准确测定分子质量的一种手段,特别适用于测定混合蛋白肽种类的相对分子质量,具有良好的灵敏度和分辨率。它是当前蛋白质组学研究的必备工具。一种与液相色谱同时结合的联用技术可以高效地鉴定肽种类。尤其是当质谱技术的各种原理串联应用时,不仅可以获得肽的相对分子质量信息,还可以确定其序列结构,该技术将在未来的蛋白质组学研究中具有决定性意义。

19、什么是高效液相色谱(HPLC)?什么是反相高效液相色谱(RP-HPLC)?

高效液相色谱的出现为多肽的分离提供了一种有利的方法。与其他化合物相比,在合适的色谱条件下,蛋白质和多肽的分离可以在短时间内完成。更重要的是,高效液相色谱法可以大规模生产生物活性肽。因此,许多学者为寻找多肽分离制备的最佳条件做了大量工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析确定是目前的研究内容。

反相高效液相色谱(RP-HPLC):结果与保留值的关系:用RP-HPLC分离肽,需要确定不同结构的肽在柱上的保留。为了获得一系列保留系数,Wilce等人。采用多元线性回归法分析了种多肽的保留性质和结构,得到了不同氨基酸组成与保留系数之间的关系。可减少2-20个氨基酸肽中极性氨基酸残基的保留时间;在10-60个氨基酸肽段中,更多的非极性氨基酸也可以减少在柱上的保留时间,而在5-25个氨基酸肽段中,更多的非极性氨基酸可以延长在柱上的保留时间。

20、为什么在RP-HPLC中使用梯度洗脱?

目前,RP-HPLC是研究多肽相关物质合成最常用的方法。但由于合成多肽中相关物质的性质不同,单纯的等度洗脱法难以全面检测产品中的各类有机杂质。

21、质谱中如何确定单同位素峰和平均同位素峰?

在低分辨率的质谱中,显示的峰通常是平均同位素峰。然而,质谱(如MALDI-TOF)的分辨率非常高。一般的小分子(如肽段)常含有4-5个同位素峰,其中分子量最小的是单同位素峰。使用质谱法检测大分子(如完整蛋白质)时,同位素峰的数量非常多,在图谱上难以区分。在这种情况下,使用平均同位素峰更有意义。

22、同位素峰之间是否有1Da的差异?

同位素肽的质量(m)一般相差1Da,但质谱检测到的峰是肽的质荷比(m/z)而不是质量本身,当肽的质荷比差异小于1时有多项收费。如果检测到的肽带一个电荷,则同位素峰之间的差值为1;如果检测到的肽段有两个电荷,则同位素峰之间的差值为0.5;如果检测到的肽段带三个电荷,则同位素峰之间的差值为0.33;等等。因此,从同位素峰之间的距离,我们可以推断肽的带电状态(z),从而推断肽的单个同位素质量[(m/z)*z]。

23、单同位素峰一定是最高的吗?

单同位素峰必须在一组峰中具有最低的质荷比,但不一定是最高的。当肽的分子量较小时,肽中的原子总数也较少,整个肽含有同位素原子的概率较小。此时,单同位素峰往往是最高峰。当肽的分子量增加时,携带同位素原子的概率增加。在这种情况下,+1Da甚至+2Da的同位素峰可能是最高的。统计结果表明,当多肽的分子量大于2Da时,该峰不是单同位素峰。

24、除了HPLC和MS,还有哪些其他肽分析方法可用?

还可提供水馏分、离子色谱、元素分析、氨基酸组成分析、圆二色谱、NMR、IR、UV、内毒素、微生物等分析。

25、肽通常携带的抗衡离子是什么?

多肽冻干粉一般配三氟乙酸盐,如果是做细胞实验或动物实验,建议换成乙酸盐或盐酸盐。

26、可以提供哪些同位素标记的肽?

可以提供一些稳定的同位素修饰肽,主要包括N15、C13和氘修饰。由于稳定同位素氨基酸原料价格昂贵,建议选择一些简单的氨基酸进行标记,如Gly、Val、Phe、Leu、Ala等。

27、影响多肽稳定性的因素有哪些?

影响合成肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋化、β-消除、聚集等。合成肽最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物和水解产物。在各种氨基酸中,天冬酰胺和谷氨酰胺容易脱酰胺(特别是在高pH和高温下);蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸最容易被氧化,对光敏感;天冬氨酸形成的肽链容易断裂,尤其是ASP-Pro和ASP-Gly肽键。肽的聚集主要是由疏水相互作用引起的。虽然目前很难准确预测哪些肽段容易聚集,至少对于一些中长肽段来说,

28、Fmoc/tBu固相合成(SPPs)如何选择树脂?

C端羧肽合成可选用Wang树脂;对于C端酰胺肽的合成,可选择RinkAmideAMResin或RinkAmideMBHAResin;对于全保护肽的合成,我们可以选择2-ClTrtResin。

29、树脂的参数是什么?参数的含义是什么?

一般树脂的参数包括载量、目数和规格,如1%DVB。

载量:单位为mmol/g,即每克树脂存在多少毫摩尔官能团。

目数:粒度一般为-目,数值越大,颗粒越细。

1%DVB:交联剂二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。

30、Fmoc保护氨基酸树脂的负载量计算方法有哪些?

Fmoc保护氨基酸树脂载量的计算一般有两种方法,一种是增重法,增加的重量除以分子量,再除以树脂的总重量。另一种是通过紫外分析。目前我司提供UV分析加载值。

31、什么样的肽可以通过紫外分析来计算肽含量?

如果肽段序列中含有Trp或Tyr,可用紫外法分析肽段的含量,根据摩尔消光系数:

色氨酸5,AU/mmole/ml

酪氨酸1,AU/mmole/ml

(nmat中性pH使用1cm比色皿)

肽的摩尔消光系数可以根据每个色氨酸或酪氨酸的系数相加,然后根据在nm处测得的吸光值按公式计算。

mg肽/ml=(AxDFxMW)/e

A,nm处的实际吸收值(1cm池),

DF,稀释因子,

MW,肽的分子量

e,肽的摩尔消光系数

32、肽与其他化合物或载体的结合应考虑哪些因素?

一些肽往往需要与一些具有特定功能的药物或化合物,或一些载体连接。这些过程需要化学键结合。通常,当肽具有氨基或羧酸官能团时,可以考虑相应的羧酸或氨基进行缩合。另一种选择是在pH8的环境中将马来酰亚胺与硫醇连接。肽可以用Cys或马来酰亚胺官能团进行修饰。马来酰亚胺改性通常可以通过3-马来酰亚胺丙酸(CAS-55-4)实现。

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