运用有机酸靶向代谢组学研究衰老与癌症 [复制链接]

前言

美国威尔康奈尔医学中心JohnBlenis和AnaP.Gomes课题组在Nature发表了题为“”的研究成果，通过蛋白质组学、（有机酸）靶向代谢组学、全转录组学等研究方法，发现丙酸代谢的副产物甲基丙二酸(MMA)在老年人的血清中增加，具有诱导转录因子SOX4的表达、重塑肿瘤细胞和微环境以促进癌症的侵袭性和发展的能力，揭示了MMA的积累代表了衰老与癌症发展之间的联系，表明MMA是晚期癌症有希望的治疗靶标。

中文标题：甲基丙二酸促癌重编程

研究对象：人血清

发表期刊：Nature

影响因子：49.

运用生物技术：蛋白质组学、（有机酸）靶向代谢组学、全转录组学

研究背景

人类从65岁开始，患癌症和死亡的风险大大增加。尽管如此，人类对年龄与癌症之间复杂关系的理解仍处于起步阶段。几十年来，这种联系主要归因于老年人对致变原的暴露时间增加。然而，这种观点并没有考虑到饮食，运动和预防新陈代谢退化小分子的作用。考虑到越来越多的证据表明，癌细胞外在因素是调控肿瘤进展的关键，研究人员提出假设，衰老可能会产生一个支持肿瘤发展和侵袭性的系统环境。

研究思路

研究结果

1.衰老是支持肿瘤发展的外在因素之一

为了验证这上述的假设，在30名年轻的（≤30岁）和30名老年的（≥60岁）健康捐献者（图1a）的10%人血清(HS)中培养了人类癌症A和HCC细胞。用年轻血清处理的大多数细胞保持其上皮形态，而用老年血清中大部分变成间充质细胞，失去极性并显示纺锤形形态。这些表型独立于供体种族，类似于上皮-间质转化(EMT)，这是一种被癌细胞劫持以获得促转移特性的发育过程。除了与侵袭性表型相关的serpine1和MMP2蛋白表达增加外，用老年血清培养的细胞显示上皮细胞钙粘蛋白的显著丧失以及间充质标志物纤连蛋白和波形蛋白的增加（图1b）。此外，还促进对化学治疗药物卡铂的抗性（图1c）。为了确定用老年血清处理的细胞是否也会显示出增强的转移潜能，用HS处理MDA-MB-乳腺癌细胞注射到无胸腺小鼠的尾静脉中。老年血清显著地增强了细胞定植肺部并形成转移性病变的能力（图1d，e）。这些数据表明，全身衰老和年龄诱导的循环因素有助于促进癌症侵袭性的获得。

图1

年龄诱导的循环因子促进癌症侵袭

a、实验设计图表；

b、在血清中培养4天的A细胞的免疫印迹；

c、在血清中培养4天的A细胞中对卡铂的抗性；

d，e、通过免疫印迹和肺定植测定评估在血清中培养5天的MDA-MB--萤光素酶细胞的转移性质

2.老年血清可诱导癌症的侵袭性，具有明显的代谢特征

在老年血清的蛋白质组学分析中，未显示癌细胞的侵袭性的促炎特征（图2）。考虑到饮食，运动和热量限制等代谢能干预癌症的易感性和结果，由此检查了供体血清的代谢组学。在有机酸代谢组学、靶向代谢组学检测到的个循环代谢物中，只有10个在统计学显著水平上改变(双侧t检验，P0.5)（表1）。考虑到它们在衰老过程中已知的作用，预计谷胱甘肽，亚精胺，谷氨酰胺和α-酮戊二酸的水平将显著下降。老年血清中只有三种代谢物持续增加：磷酸烯醇丙酮酸，喹啉酸和甲基丙二酸(MMA)。为了测试这三种代谢物中的任何一种是否负责诱导促侵袭作用，用每种代谢物处理A细胞。只有MMA诱导了完全的前侵袭性上皮-间质转化样表型，上皮细胞钙粘蛋白下降，同时纤维连接蛋白和波形蛋白增加（图3）。

图2

60个人血清的蛋白质组学火山图

表1

靶向代谢组学检测的10种在统计学上显著改变的代谢物

图3

三种代谢物诱导癌细胞侵袭结果

3.代谢物MMA可诱导癌细胞侵袭

MMA主要是丙酸代谢副产物的二羧酸。丙酰辅酶A是由支链氨基酸和奇数链脂肪酸的分解代谢产生的，其生成的琥珀酰辅酶A的方式依赖于维生素B12为三羧酸循环提供燃料。MMA的积累是由于该途径中酶的通量增加和（或）失调所致，并且是一组称为甲基丙二酸血症的先天性代谢疾病以及维生素B12缺乏症的标志物。

通过测量所有60位供体血清中MMA的绝对浓度，其结果表明，老年血清（15–80μM）中MMA水平高于年轻血清（0.1–1.5μM）（图4a）。此外，在10个异常样本(5个来自未诱导EMT的老年捐赠者，5个来自诱导EMT的年轻捐赠者)中，MMA水平始终与在癌细胞中观察到的表型相关(图5g)。已知维生素B12水平会随着年龄的增长而下降，通过对血清中维生素B12的测量显示，老年捐献者的维生素B12水平略有下降（图5h），然而，这种下降与离群样本中的MMA水平无关（图5i）。虽然不能排除维生素B12缺乏导致MMA随年龄增加的可能性，但其他因素如主要器官丙酸代谢的失调也可能与此有关。

为了更好地理解MMA的促侵袭性质，用MMA处理HCC，A和MCF-10A细胞。1mM及以上的浓度足以诱导EMT样表型和促侵袭性蛋白的表达（图4b）。MMA还能增加细胞的迁移和侵袭能力（图4c），并促进干细胞样特性。用MMA体外处理MDA-MB-细胞增加了侵袭性标志物并且足以以浓度依赖性方式稳健地增加细胞以无胸腺小鼠肺定殖的能力（图4d）。为了评估血清中的另一种成分是否可以促进MMA进入癌细胞，采用两种不影响MMA等极性代谢物的方法去除了脂质或大于3kDa分子的老年血清，结果表明诱导促侵袭性质的能力被消除，同时血清MMA水平显著降低。这意味着负责该表型的MMA与血清中大于3kDa的脂质结构复合，促进其进入癌细胞。

总之，与脂质结构复合的MMA是一种循环因子，有助于癌细胞衰老的促侵袭作用，并足以驱动肿瘤进展和侵袭性。

图4

MMA诱导癌细胞的侵袭性特征

a、所有血清样品中MMA的浓度；

b、用MMA处理10天的A细胞的免疫印迹；

c、用MMA处理10天的MCF-10A细胞的迁移力和侵袭测定；

d、用MMA处理5天的MDA-MB--荧光素酶细胞的肺定植测定；

e、血清MMA最终浓度；

f、原发肿瘤的生物发光强度；

g、用MDA-MB--荧光素酶细胞转移至每天皮下注射MMA的小鼠；

h、用MDA-MB--荧光素酶细胞异种移植并用MMA皮下或通过饮用水处理的小鼠的Kaplan-Meier曲线

图5

异常样本与整体样本

g、异常样本的MMA浓度；

h、整体样本的维生素B12浓度；

i、异常样本的维生素B12浓度

4.MMA通过激活TGFβ信号传导和随后诱导SOX4触发促侵袭性转录重编程

为了研究MMA如何促进观察到的细胞可塑性，用MMA处理10天的A细胞中进行了全转录组学分析。发现MMA诱导显著的转录重编程。基因集富集分析(GSEA)显示MMA调节与细胞命运决定相关的遗传程序。通过筛选MMA处理后表达上调的转录因子，发现这些最上调的一种转录因子是SOX4。在用不同浓度的MMA处理的各种细胞模型中以及在用老化血清培养的细胞中SOX4的水平显著增加（图6a，b）。用MMA或用老年血清处理后，细胞在无胸腺小鼠的肺中形成集落（图6c，d）。

接下来研究MMA如何改变SOX4水平。通过RNA测序数据的进一步分析显示TGFβ信号传导途径的几个组分增加，包括TGFβ-2配体的上调。证实了TGFβ-2mRNA的增加，其与用MMA处理的癌细胞培养基中TGFβ-2丰度随时间的增加相关（图6e）。此外，为支持这些发现的生理相关性，对来自循环MMA水平升高的小鼠的肿瘤组织的分析显示，TGFβ-2mRNA显著上调，同时诱导TGFβ信号传导和SOX4上调（图6f，g）。为了测试TGFβ信号传导的激活是否负责SOX4的上调，同时用MMA和TGFβ受体抑制剂或泛TGFβ中和抗体处理癌细胞。培养基中TGFβ受体的抑制和TGFβ配体的中和足以阻断MMA诱导SOX4表达和促侵袭性质的能力（图6h）。这些数据表明MMA依赖于以自分泌方式激活TGFβ信号传导以诱导SOX4，并因此诱导维持肿瘤进展的细胞可塑性所必需的转录重编程。

图6

MMA通过激活TGFβ信号传导和随后诱导SOX4触发促侵袭性转录重编程

a，b、用MMA（血清）处理10天的免疫印迹；

c，d、5天内用SOX4基因沉默5mMMMA（老年血清）处理的MDA-MB--荧光素酶细胞的肺定植测定；

e、经5mMMMA处理的A细胞的条件培养基中TGFβ-2配体的水平；

f，g、通过qPCR（免疫印迹）测定注射较低剂量MMA的小鼠肿瘤样品中的TGFβ-2mRNA；

h、在TGFβ中和抗体存在下用5mMMMA处理的A细胞的免疫印迹

研究结论

综上所述，本研究结果表明机体衰老的代谢失调有助于肿瘤发展的侵袭性特性。具体而言，衰老促进MMA的增加，这反过来赋予癌细胞作为转移性病变迁移，侵入，存活和繁殖所必需的性质，这导致癌症相关存活率降低。尽管需要更深入的研究来充分确定导致致瘤过程的年龄驱动变化的范围，但本研究证明了代谢重编程是衰老与肿瘤发生间的重要关系。

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本文研究了促进癌细胞发展和侵袭的外在因素—衰老。通过在两组年龄的人血清中培养癌细胞证明了衰老会形成一个有助于癌细胞发展和侵袭的身体环境。通过有机酸靶向代谢组学分析了人血清的代谢物组成，发现只有三种代谢物在老年血清种增加，并最终确定了甲基丙二酸MMA与脂质结合的复合因子负责诱导癌细胞侵袭的作用。

文末看点

上海鹿明生物科技有限公司多年来，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组学和代谢组学为基础的多层组学整合实验与分析的团队。目前在多层组学研究已经有了成熟的技术方法。

有机酸代谢组学可以用在哪些研究呢？

疾病标志物筛选

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