得白癜风怎么治 https://disease.39.net/bjzkbdfyy/240601/x1pfujs.html蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（dyebindinglysine，DBL）测定玉米种子中赖氨酸含量。
Ⅰ茚三酮显色法
一、原理
谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的c-NHz，它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。
选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料
不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程60~90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。
（二）仪器设备
型分光光度计、水浴锅，试管，圆头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）。
（三）试剂
（1）缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60mL蒸馏水中，加入10mL8%的甲酸，最后加水到mL。
（2）茚三酮试剂：称取1g茚三酮和1g氯化镉（CdCl2·H2O），加入25mL上述缓冲溶液和75mL乙二醇，室温下放置一天、第二天使用。若出现沉淀、则过滤后使用。该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜放置过久，也不能现用现配。
（3）4%和2%无水碳酸钠溶液各50mL。
（4）标准亮氮酸溶液，准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后定容至50mL，该溶液亮氨酸浓度为μg/mL。
准确吸取上述母液1mL、3mL、5mL、7mL、9mL，分别稀释至25mL，待用。
三、实验步骤
（一）绘制标准曲线
准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5mL，分别放入5支试管中，每种浓度做三个重复。再取一支试管加入0.5mL蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加人0.5mL的4%碳酸钠溶液和2mL茚三酮试剂（头一天配好的），混匀，在80℃恒温水浴上保温30min。取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，然后向每管内加入5mL的95%乙醇，摇匀，在分光光度计上nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸光度。以吸光度值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标，绘出标准曲线，并求出曲线的斜率。
（二）样品的测定
准确称取已脱脂的各种玉米种子干粉各25mL，每个品种做三个重复。放入试管中（试管应预先烘干），加入约mg细石英砂（估计数字）和1mL2%碳酸钠溶液，用圆头玻棒充分搅拌2min，注意切勿将试管挤破。将试管放入80℃恒温水浴中，提取10min，应常搅动。取出试管，向每管内按顺序加入2mL茚三酮试剂，混匀，放入80℃恒温水浴中，保温显色30min，同时以蒸馏水做一空白对照，取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，以下步骤与标准曲线做法相同。加完乙醇后进行过滤，用滤液进行比色，读取吸光度。若样品颜色过深，则可取一定量的滤液用95%乙醇稀释后比色，吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。
在标准曲线上查出相当的亮氨酸含量。一般作物的籽粒中，蛋白质含量约为干重的10%~20%，富含蛋白的种子中则为30%~50%。赖氨酸含量约为3~7g/16g氮。
四、结果计算
按下列公式进行计算：
（1）样品要粉碎成细粉，称量要精确到0.1mg。
（2）样品与石英砂要充分研磨提取，每次操作要一致。
（3）茚三酮试剂要头天配制，第二天使用，切不可久放。
（4）恒温水浴上提取和显色时间要严格控制。
（5）比色时的顺序要与加茚三酮试剂的顺序相同。
Ⅱ染料结合法（DBL）
一、原理
谷物蛋白中都含有一定数量的碱性氨基酸，如Arg、His、Lys的碱性基团分别是-胍基、β-咪唑基及ε-氨基，在pH2~3的缓冲液中，这些碱性基团均带正电荷，当在此溶液中加入一定或过量的偶氮染料（如酸性橙-12），此染料以阴离子存在于溶液中，并与带正电荷的碱性基团作用，定量地生成不溶解的结合物。但由于染料与这三种碱性氨基酸均能结合，为此，可在样品中加入微量的丙酸酐，使其在一定条件下（pH2~3）与赖氨酸的ε-氨基起特异的酰化作用，目的是掩蔽氨基酸中的ε-氨基，防止它与染料结合。同时，另取一份样品，不经酰化处理、并加入数量相同的染料。平衡后测定染料的结合量（DBL），根据两次测
定染料结合量的差值，即可求得赖氨酸的含量。此法适于大批分析样品的快速筛选。其化学反应式如下。
1.氨基酸酰化作用的反应式
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料同上。
（二）仪器设备
微型粉碎机（筛孔直径为0.05cm）、分析天平，索氏振荡器，GXD-型蛋白质分析仪，离心机及离心管，容量瓶、移液管、滴定管及管架、加样器、烧杯等。
（三）试剂
（1）磷酸缓冲液：3.40gKH，PO.和20.00g草酸（H2C2O4·2H2O）分别溶于水中，定量地转入0mL容量瓶中。然后再加入1，7mL.85%H3PO4、60mL冰醋酸和1mL丙酸，用蒸馏水定容至刻度。
（2）染料溶液：准确称取1.g酸性橙-12（Acidorange-12，相对分子质量为.37）。用磷酸缓冲液溶解并定容至0mL。此溶液的浓度是3.89mmol/L，或每毫升含染料1.mg。（由于染料的来源不同，它的纯度也不同，故须对染料的纯度进行校正）。
（3）半饱和醋酸钠溶液：取gNaAc+3H：0溶液后定容至0mL。pH为3.5左右。
（4）丙酸酐。
三、实验步骤
（一）标准回归方程的制作
用滴定管取出1.mg/mL染料液分别为5mL、8mL、10mL、12mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL至9个50mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度。用蛋白质分析仪分别测出每一溶液的透光度（T），然后换算成吸光度。以吸光度y和染料溶液浓度x，求测y随x而变的回归方程。
※注：因染料的颜色较深，测定时不灵敏，为此，可将1.mg/mL染料40mL加水25mL，让其透光率为0；以40mL1.mg/mL染料加水mL，调其透光度为87%，然后再测定各标准溶液求其T值，再换算成吸光度。
（二）样品的测定
1.粉碎
将待测的各种谷物种子10g置微型粉碎机中分别粉碎（粉碎机转速为r/min）约0.5min，回收全部样品，充分混匀样品，并在80℃烘箱中烘2h左右，然后放至干燥器中冷却。
2.称重
称取样品两份，其中一份为酰化样品，称重为mg；另一份为未酰化的样品，称重为mg，分别倒至两个离心管中。
3.反应
（1）在酰化样品管中加入1mL半饱和醋酸钠溶液及0.1mL丙酸酐。
（2）在未酰化样品管中加入1mL半饱和醋酸钠溶液及0.1mL磷酸缓冲液。
（3）各管摇匀后，加塞，在搅拌器或振荡器上搅拌15min，使之充分酰化，然后分别用快速加样器准确加入10mL1.mg/mL的染料液，塞紧塞子后，在振荡机（水平式）上振荡1h，反应后的混合液立即以0~3r/min离心8~12min。
4.测定
将各管离心后的上清液用GXD-型蛋白质分析仪测定透光度T值。
四、结果计算
（一）单位样品结合的染料量
根据所测定剩余染料的透光度换算成吸光度后，由标准回归方程算出酰化管中和未酰化管中剩余染料的浓度，再根据下列公式计算出单位样品结合的染料量。
式中：C为加入染料溶液的浓度，mg/mL，即1.mg/mL；V为加入染料的体积，10mL；Vc为染料浓度为1.mg/mL时的体积；CA、CB分别为酰化样品和未酰化样品与染料作用后剩余的染料浓度，mg/mL；WA、WB。分别为酰化管和未酰化管中样品的重量；DA与DB分别为酰化和未酰化样品的染料结合量（即单位重量样品结合的染料量）；1.1为加入醋酸钠与丙酸酐的毫升数（或醋酸钠和磷酸缓冲液的毫升数）之和。
（二）赖氨酸含量的计算
根据单位重量样品结合的染料量，计算出未酰化管和酰化管的差值，然后再计算赖氨酸的百分含量。
