限制性内切酶酶切过程中的常见问题及应对策 [复制链接]

导读

限制性内切酶是分子实验中经常用到的一类酶，目前已经有多种，其中用于商业上大约有种，限制性内切酶最常见的应用是分子克隆，但是除此之外，在疫苗研发，基因测序，SNP分型等研究领域，也有着广泛的应用。限制性内切酶使用看起来很简单，但是也经常会出现一些意外情况，例如酶切不完全，有杂带，酶切后连接不好等各种问题，这时候就需要根据实验结果来分析是什么原因造成的，因此了解影响酶切的关键因素，可以帮助来解决实验中遇到的很多问题。一般来说，在进行酶切反应时，需要考虑的因素有很多，例如底物和酶量，酶切温度，反应条件，酶的星号活性等。

限制性内切酶酶切过程中的几个基本概念

1

酶使用量：一般酶是用Unit来作为单位，是用来衡量其催化活性大小的，一般定义为1U是在50μL反应体系中，60min内完全酶切1μgλDNA所使用的酶的量。根据不同的底物DNA，选择的酶量也不一定完全相同。

02

酶切温度：

大多数

限制性

内切酶的最适反应温度是37℃，

但是

有一些

限制性

内切

酶是经过改造

过

的，其酶切温度可能高于37℃，也可能低于37℃。

03

反应buffer：

是指内切酶适配的反应

buffer，因为内切酶必须在一定的盐离子浓度和特定的pH值下才能发挥催化作用，这种反应条件就是由buffer来提供，不同的酶在不同的反应buffer中的活性不一样。

04

星号活性：

同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，例如酶过量、甘油浓度过高、盐离子浓度过低、PH改变、反应液中存在Mg

2+

以外的阳离子、存在有机溶剂影响等，酶切割位点专一性发生改变。

那么在我们实验中，一般会遇到哪些问题呢？遇到这些问题后又如何去应对呢？

问题一：DNA酶切不完全

可能的原因

1

限制性内切酶活性下降

2

DNA不纯，反应条件不佳

3

DNA酶切位点上的碱基被甲基化

4

部分反应溶液粘在管壁上

5

反应溶液、温度或强烈振荡致使酶变性失活

6

限制性内切酶含有甘油，粘度大导致取样不准

7

识别位点过于接近DNA末端

8

DNA可能形成超螺旋等

相应的对策

1

用已知含目的酶切位点的对照DNA测试该酶活性

2

纯化DNA；按比例使用新鲜缓冲液重复实验

3

换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶，重新将质粒DNA转化至dcm-、dam-基因型的菌株；将该DNA底物与λDNA混匀进行酶切验证

4

全部酶切组分加入完成后，进行混匀并短暂离心

5

使用推荐的反应缓冲液及温度，避免强烈振荡

6

将酶稀释，增大取样体积

7

一般在识别位点两端各加3个保护碱基可确保酶切效率

8

不同酶对超螺旋结构DNA消化效率不一样，可适当加大酶量

问题二：酶切后的DNA片段数目多于理论值

可能的原因

1

内切酶星号活性

2

其它内切酶污染

3

底物中含其它DNA杂质

相应的对策

1

检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶/DNA比值过大均可导致星状活性，降低酶的使用量

2

用λDNA作底物检查酶切结果

3

电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段

问题三：酶切后的DNA片段连接效率低

可能的原因

1

含磷酸盐的浓度高

2

内切酶失活不全或含有ATP酶

3

平末端连接

4

外切酶污染

5

连接缓冲液不合适

相应的对策

1

纯化回收DNA，去除磷酸盐

2

延长灭活时间或纯化DNA

3

加大T4DNA连接酶的用量

4

减少酶用量，缩短反应时间，纯化回收DNA

5

重新配制连接缓冲液，或向连接反应buffer中补加ATP

以上是小编对于限制性内切酶中常遇到的一些问题和相应的对策进行总结，希望可以帮助大家去解决一些实验中的问题，另外ABclonal也提供了多种内切酶可供大家选购！

ABclonal

公司简介

爱博泰克生物科技有限公司（ABclonalTechnologyCo.,Ltd.）成立于年，作为生命科学解决方案的提供商，旨在为更多的科研工作者、IVD企业、新技术开发企业提供抗体、酶、NGS产品和蛋白制品等全套解决方案。

ABclonal现有波士顿抗体与蛋白研发中心、上海诊断与科研分子酶产品研发基地以及中国武汉光谷诊断与科研免疫产品生产和研发基地。经过多年的深耕与发展，ABclonal已拥有免疫与分子酶两大技术平台，集新型分子酶、全领域应用NGS建库解决方案、新平台单克隆抗体与高活性蛋白制品的研发与生产于一体。ABclonal致力成为产业科研转化的核心企业，向生命科学研究工作者和应用企业提供全套可靠的技术解决方案。