基因编辑技术作为生命科学几十年不遇的颠覆性技术，已在农业领域得到了广泛应用。基因组编辑将给植物育种带来革命性的变化，并可能有助于确保全球粮食供应。基于基因组编辑的植物改良新技术，是传统育种无法实现的。年2月12日，中院遗传发育研究所高彩霞研究员在Cell发表了题为Genomeengineeringforcropimprovementandfutureagriculture的综述文章，重点基因组编辑的下一代植物育种技术如何突破传统育种的瓶颈问题，如何实现定向诱变与精准育种、多倍体植物中多个拷贝的基因编辑、基因家族的基因编辑、QTLs的基因编辑、从头驯化、单倍体诱导与人工无融合生殖大规模的筛选等。最后还对基因组编辑技术在促进未来粮食生产时面临的挑战和待解决的问题进行讨论。传统的植物育种技术主要包括杂交育种和诱变育种，随着基因工程技术的发展，转基因育种及基因组编辑育种技术也开始被利用，成为新的育种技术（图1）。图1将新性状引入优良作物品种的常用植物育种技术基因组编辑育种在农业领域被称之为“5G”育种技术。最近开发的与CRISPR相关的工具，如碱基编辑和Prime编辑，极大地扩大了基因组编辑的范围，允许创建精确的核苷酸替换和有针对性的DNA删除和插入。1植物基因组编辑的一般程序可分为六个步骤：(1)根据目标序列选择合适的核酸酶；(2)构建基因组编辑载体；(3)使用原生质体(从酶消化组织中释放的无壁植物细胞；可选步骤)验证这些载体的活性；(4)将基因组编辑载体导入植物细胞；(5)通过组织培养将基因组编辑后的细胞再生为植株；以及(6)对得到的基因组编辑后的植物进行筛选和分型(图A)。图2植物基因组编辑的一般程序2植物基因组编辑产生的遗传修饰使用最广泛的CRISPR-Cas系统是Cas9和Cas12a复合物，这两种复合物都是执行核酸切割的单效蛋白。最近，还开发了用于植物基因组编辑的Cas12b系统。所有这些系统都依赖crRNAs来引导Cas蛋白到靶序列。Cas9蛋白需要额外的RNA分子，称为反式作用crRNA(TracrRNA)，它可以与相应的crRNA人工融合，形成sgRNA。CRISPR-CAS系统可以通过简单地将DNA靶序列设计成crRNAs或sgRNAs来编程。已经确定并利用了具有不同PAM(Protspacer相邻基序)特异性的各种CAS同源基因和变体，以最大限度地扩大这些工具的编辑范围。CRISPR-CAS系统和新开发的工具，如碱基编辑器（图3B)和Prime编辑器（图3C)极大地扩大了其潜在的应用。到目前为止，基因组编辑已被用于在植物中产生各种可遗传的基因组修饰，包括：
（1）HDR介导的基因组编辑可以产生精确的基因替换、点突变以及DNA插入和删除(图3A)，但HDR在植物细胞中的效率极低;
（2）碱基编辑器（图3B)；
（3）先导编辑器(PrimeEditor)（图3C）;
（4）小随机插入/缺失(INDELs)(图3D)；
（5）点突变或核苷酸替换(图3E)；
（6）DNA片段插入(图3F)；
（7）DNA片段缺失(图3G)；
（8）以及有针对性的染色体重排(图3H)。
图3植物基因组编辑产生的遗传修饰3涉及基因组编辑的下一代植物育种技术图4基于基因组编辑的作物改良策略定向诱变与精准育种植物杂交的障碍阻碍了传统育种技术所能产生的不同物种之间共享性状。因为支撑主要性状(如开花时间、抗性、株高和种子大小)的分子机制通常在不同的植物物种中是保守的，利用基因组编辑技术可以直接改良各种作物物种的复杂性状(图4A)。因此，原则上，重要的特征可以在不同物种之间共享。编辑白粉病抗性基因(MLO)证明了这种跨物种特性的“共享”。当紧密连锁的位点必须分离时，依赖于基因重组的杂交育种是具有挑战性的，特别是当一个位点是有益的，而另一个是有害的。打破这样的遗传连锁需要广泛的回交，这很耗时，在某些情况下甚至是不可能的。在这种情况下，可以通过两种方式使用编辑来改变有害等位基因。一种方法是诱导染色体重排以增加重组事件，因为SSN有能力在植物中创造相互的染色体易位和染色体内倒位（图4A)。另一种方法是直接编辑或删除不需要的等位基因，从而绕过传统的导入(图4A)。编辑已经被用来通过敲除番茄中不需要的等位基因来打破连锁阻力，最近还被用来结合玉米中两个紧密相连的遗传等位基因。小麦中的一种新的RecQ解旋酶基因控制着全基因组的基因转换，并代表了一种内源“连锁断裂机制”，在DSB修复过程中将一个等位基因转换为另一个等位基因。通过基因组编辑利用同样的机制，可以提供一种新的方法来打破其他物种的遗传连锁。多重基因组编辑和性状叠加与其他SSNs相比，CRISPR的一个主要优势是能够同时编辑多个目标位点。多重基因编辑将极大地加速重要性状的基因堆积。当使用转移RNA加工、核酶自切割、crRNA阵列或Csy4核糖核酸酶切割时，几个sgRNA可以在同一细胞中表达。多倍体植物中多个拷贝的基因编辑：大约四分之一的维管植物是多倍体的，其中许多植物具有重要的农业价值。多倍体中的大多数基因存在于多个拷贝(同源基因)中，这些拷贝(同源基因)执行相同的功能来控制特定的植物性状。这些同源基因必须同时突变才能产生隐性变化。基因组编辑非常适合这一目的(图4B)。这种方法首先在面包小麦中得到证明，同时编辑MLO的三个同源等位基因可以使其对一种主要的真菌疾病--白粉病产生抗性。从那时起，基因组编辑被用于在其他多倍体作物中产生有价值的农艺性状。基因剂量对剂量依赖的表型很重要，也可以通过多倍体作物的基因编辑来改变。基因家族的基因编辑：对16个完全测序的植物基因组的分析表明，72%的蛋白质编码基因可以归入平行基因家族。基因家族的成员通常具有相似的结构和重叠的功能。这种功能冗余提供了遗传稳健性。因此，敲除一个平行基因可能是不够的，通常需要突变两个或更多的平行基因才能产生表型效应。多路复用编辑可用于此目的(图4B)。例如，小麦中的面筋基因家族包括至少29个α-醇溶蛋白、18个γ-醇溶蛋白和10个ω-醇溶蛋白的编码基因，以及16个低分子量谷蛋白和6个高分子量谷蛋白。α-，γ-和ω-醇溶蛋白中的免疫原性表位以及(在较小程度上)低分子量谷蛋白中的免疫原性表位在1%-2%的人群中会引发自身免疫性疾病乳糜泻。由于潜在的遗传复杂性，常规育种很难获得无麸质小麦。利用CRISPR-CAS9成功地同时编辑了六倍体面包小麦的多个α-和γ-醇溶蛋白基因。令人印象深刻的是，35个基因在同一个株系成功突变，免疫反应性降低了85%。一种更有效和更精确的方法是使用碱基编辑器和prime编辑器来专门修改免疫原性表位中的氨基酸。QTLs的基因编辑数量性状在农艺上具有重要意义。这些性状是多基因的，受数量性状基因座(QTL)控制，每个QTL对表型的直接影响很小，但相互作用。QTL不是以简单的孟德尔方式遗传的，因此极难研究和操作。研究植物QTL的遗传变异主要是为了作物改良。基因组编辑通过提供将遗传多态性与表型差异联系起来的工具，显示出克服这些限制的巨大潜力(图4C)：基于深度测序的GWAS和泛基因组技术揭示了大量的单核苷酸多态性(SNPs)和结构变异(SVS)与植物数量性状变异有关。其中许多SNPs和SVS位于基因的非编码区或调节区，这使得分子特征和确认变得复杂。基因组编辑通过提供将遗传多态性与表型差异联系起来的工具，显示出克服这些限制的巨大潜力(图4C)，QTL编辑可用于将多个所需的数量等位基因直接引入优良作物品种，从而避免对密集杂交的要求。CRISPR-Cas9被用来产生数百个目标突变，以便于对番茄顺式调控区域与表型变异之间的关联进行系统分析；基因组编辑也被用于通过候选QTL的高通量编辑屏幕来识别QTL。使用CRISPR-Cas9和碱基编辑来编辑基因的上游开放阅读框架(UORF)已被用于微调植物中的目标蛋白表达水平，促进植物生产力、食品质量和对胁迫的适应之间的平衡。此外，CRISPR多重策略可用于修改候选QTL的组合或定义的QTL区域中的所有基因，以导致可测量表型的变化。从头驯化通过基因组编辑对野生物种进行从头驯化提供了一种前景看好的替代育种策略（图4D)今天所有的主要农作物都是从几千年前的野生祖先驯化而来的。驯化丰富了提高作物生产力的性状，如理想的植株结构、高产和容易收获；然而，随着时间的推移，这会导致遗传瓶颈，导致遗传多样性下降和抗逆性丧失。为了改良栽培作物，野生近亲的有益性状已经被杂交到它们身上。不幸的是，这种类型的杂交只可能用于单基因性状，而野生物种中的许多有用性状，如非生物抗逆性，都是多基因的，很难在杂交和回交过程中通过分离来修复。通过基因组编辑对野生物种进行从头驯化提供了一种前景看好的替代育种策略。作为概念的证明，成功地进行了驯化基因的多重编辑以部分驯化野生番茄(S.pimpinellifolium)，同时保留了野生品系的抗逆性。野生稻的驯化也是一个有吸引力的目标。异源四倍体野生稻OryzaAlta生物量大，能抵抗生物和非生物胁迫，是一种很有前途的作物。最近发现了一个理想的阿尔塔野生稻生态型，并利用CRISPR创造了具有改良农业性状的突变系。这些研究为野生植物的加速驯化奠定了基础。重新驯化还具有巨大的潜力，可以提高孤儿作物的产量和营养含量，以适应当地的需要。这些野生作物的产量比栽培作物低得多，但它们对环境压力有抵抗力，可以在边际土地上种植（图4D）表明，地面樱桃(PhysalisPruinosa)是一种与番茄远缘的孤儿作物，通过加速驯化可以快速改良。其他孤儿作物，如高粱、谷子、豇豆、藜麦、木薯和画眉草，都是新驯化的良好原料。除了经典育种和其他技术之外，创建完全驯化的新栽培作物可能还需要反复编辑活动。利用重新驯化将孤儿作物转化为新的超级作物可能是有效的。单倍体诱导与人工无融合生殖直接编辑内源植物基因是获得单倍体诱导系的有效途径（图4e)：传统的植物育种需要六到七代的自花授粉，才能培育出高度纯合、稳定的品种。加倍单倍体的产生有效地在两代内修复了重组单倍体基因组，从而大大加快了育种进程，与传统冗长的育种程序相比，降低了成本。直接编辑内源植物基因是获得单倍体诱导系的有效途径。MTL/PLA1/NLD(编码精子细胞特异性磷脂酶)的敲除导致玉米、水稻和小麦中有缺陷的雄配子体的产生和母体单倍体诱导表型的产生。通过CRISPR介导的突变操作DMP在玉米中也获得了类似的结果（图4e)。RISPR-Cas9介导的CENH3N端α-螺旋的缺失导致了拟南芥单倍体诱导系的产生(年)。小麦TaCENH3α的基因组编辑导致单倍体诱导率为7%；编辑杂合基因型的恢复移码等位基因引发了比纯合子组合更高的父本单倍体诱导率(年)。重要的是，通过单倍体诱导编辑(HI-Edit)（年)和单倍体诱导因子介导的基因组编辑(IMGE)(a)，成功地修改了几个转化顽固性作物品种。HI-Edit/IMGE可以将基因组直接修改到任何精英商业背景中，并在单倍体诱导系授粉时产生不含转基因的编辑作物，该单倍体诱导系携带针对所需农艺性状的CRISPR-CAS盒。种子可以通过一种称为无融合生殖的过程进行无性繁殖：开花植物(被子植物)的种子发育是由双受精触发的，在双受精过程中，单倍体卵细胞和二倍体中央细胞分别与精子细胞融合，产生二倍体胚胎和三倍体胚乳(年)。在一些物种中，种子可以通过一种称为无融合生殖的过程进行无性繁殖。这一过程导致了基因相同的种子的产生，这在植物育种中有许多应用(年)。无融合生殖在多种植物中自然发生。然而，这一过程不会发生在大多数主要作物中，而且很难通过常规育种进行工程设计(年)。无融合生殖需要三个主要步骤：未减数分裂的雌配子体的形成(无融合生殖)，没有卵细胞受精的配子体胚胎发育(孤雌生殖)和胚乳的受精。通过CRISPR-Cas9敲除减数分裂基因Rec8、PAIR1和OSD1，可以诱导水稻无融合分裂，或“有丝分裂而不是减数分裂”）图4e)。创造无融合生殖植物的一种方法是基因组消除。证明了Cas9诱导的水稻母系(MTL)基因敲除导致了单倍体的诱导，同时编辑OSD1、PAIR1、Rec8和MTL产生了产生克隆种子的植株。另一种方法是在不受精的情况下触发雌配子的胚胎发育(图4e)。BBM1在未受精卵细胞中的错误表达引发了水稻的胚胎发生。将这一过程与编辑产生的MIME突变相结合，导致了人工无融合生殖。由于这两种方法中使用的基因在其他植物中都是保守的，这些方法应该也适用于其他主要作物。尽管克隆种子在水稻上取得了成功，但在实现人工无融合生殖在现代农业中的实际应用之前，还需要进行更多的改进，例如在杂交优势的固定方面。控制胚乳受精可以促进作物合成无融合生殖的发生。大规模的遗传筛选为了将基因组编辑应用于植物育种，了解有益性状的遗传规律是必不可少的。CRISPR-CAS9筛查可作为一种前向遗传筛查工具，用于对基因型和表型之间的关系进行全基因组表征（)。在这种类型的筛选中，Cas9与针对植物中许多或所有基因的sgRNAs文库一起表达。在植物转化后，经过编辑的植物被再生，其后代被筛选出感兴趣的性状。通过对富含变异体的sgRNA进行测序来鉴定感兴趣的基因或突变体。CRISPR-Cas9已成功用于水稻全基因组筛选，并成功地用于产生番茄、大豆和玉米（图4F)的突变群体。这种方法比化学、物理或转座子诱变更有效地在植物中产生全基因组突变。然而，目前植物中的CRISPR筛选需要费力的植物组织培养程序。在未来，也许基于单细胞或原生质体的筛选方法可以利用强大的表型读数和单细胞测序来加速未来的性状发现。CRISPR-CAS大规模筛选的另一个重要应用包括在基因或其功能域引入饱和突变，然后进行定向进化筛选以进行性状工程和新性状发现(图4F)。这种方法需要使用sgRNA文库产生各种突变体，以及筛选和选择具有所需特性的植物的有效方法(年)。CRISPR-Cas9已成功地被开发用于在本地植物环境中进行定向蛋白质进化，方法是将Cas9与sgRNAs文库耦合，该文库可耕耘相关编码序列的两条链上的所有潜在位点(年)。然而，Cas9诱导的主要突变是indel相关的移码，使得很难产生产生SNPs所需的所有氨基酸替代，SNPs是自然界中最常见的遗传变异来源(年)。碱基编辑器是克服这一困难的理想工具。例如，将sgRNAs文库与CBE或ABE一起导入植物细胞，通过在水稻中产生OsACC的功能变体来促进除草剂抗性的进化(b)。此外，开发了双胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，以同时产生C?G到T?A和A?T到G?C的转化，并已用于对OsACC所选择的靶域进行近饱和突变(a)。在这些由CRISPR指导的进化运动中，既发现了已知的变异，也发现了新的变异。然而，只有数量有限的植物蛋白可以用这种方式进行工程。利用单细胞或原生质体进行迭代诱变和选择的方法可以在未来扩大该方法的实用性。4挑战与未来展望该文认为首先需要提高精准的基因组编辑效率，其次需要改善基因编辑的特异性，还需优化植物细胞输送和再生系统，基于科学的分类监管也将有利于释放基因组编辑在保障粮食安全上的巨大潜力。同时，该文对植物基因组编辑技术的发展进行了展望，CRISPR-CAS系统在改进植物设计和合成生物学方面、植物微生物组工程具有巨大的潜力。5结论综上，植物基因组编辑技术的发展为植物育种提供了广泛的机会。通过基因组编辑进行高效、精确和有针对性的突变为下一代育种战略奠定了基础，这些战略将彻底改变农业的未来。为了充分发挥植物基因组编辑的潜力，必须探索所有的方法。基因组编辑允许将遗传特征的组合合理地设计到作物中。当这些精确而高效的技术用于快速育种时，其结果与经典育种的结果相似。然而，基于基因组编辑的下一代育种不太可能完全取代传统的育种方法，只有与其他技术相结合，如高通量表型分析、基因组选择和快速育种，才能保证基因组编辑在农业中的广泛实施。这种多学科的方法将推动植物育种，帮助确保第二次绿色革命，以满足在不断变化的气候条件下快速增长的全球人口日益增长的粮食需求。论文链接：
