热胁迫引起的稻米垩白是水稻生产面临的一个主要问题，特别是在气候变化下。虽然胚乳中垩白的形成受到氮素的抑制，但对这一过程的细胞特异性动力学知之甚少。因此本研究使用皮升压力探针电喷雾电离质谱技术（picolitrepressure-probeelectrospray-ionizationmassspectrometry），结合透射电子显微镜和膨压测量，研究了在受控环境条件下完整水稻种子的单个胚乳细胞中热诱导产生的垩白。
主要结果
1.水稻外观品质
在两种不加热处理(26℃，含或不含N)中，籽粒均未出现背白，完善籽粒的比例相同（表1；图1a）。在不添加N的热处理(34℃)下，背白籽粒的比例为66.4%，导致完善籽粒的数量大幅减少（表1；图1b）。相比之下，施氮后加热（N+34℃）改善了水稻外观品质，显著降低了背白籽粒的比例，仅为7.6%，而完善籽粒的比例增加到52%(表1；图1c)。完善籽粒和背白籽粒的干重不受处理的影响(表1)，但34℃和N+34℃处理所有籽粒的平均干重加起来有所下降。考虑到26℃和N+26℃处理对水稻外观性状无显著影响，后续试验仅采用26℃、34℃和N+34℃处理进行。在籽粒大小方面，34℃和N+34℃处理的背白籽粒宽度相对于26℃的完善籽粒略有下降，但长度和厚度没有差异。因此，计算出的截面积和体积也没有差异。在34℃处理的背白籽粒中，垩白面积对应横切面的17.4%（图1B）。表1水稻稻米外观品质与粒重
2.垩白区域显微镜观察
利用光学显微镜和透射电镜观察到OE细胞位于籽粒成熟时垩白频率最高的背侧。从26℃、34℃和N+34℃处理收集的籽粒切片进行双染色并使用光学显微镜观察，淀粉颗粒和蛋白质分别被染成红紫色和蓝色（图1D-F）。结果显示胚乳横切面上的细胞数量没有显著差异，尽管与26℃处理相比，两种加热处理位于垩白区的OE细胞体积都有所减少。在26℃处理中，OE细胞密集排列，通常有大量发育良好的淀粉体和成熟的蛋白体，它们大多位于细胞质的外围（图1D）。相比之下，34℃处理下的淀粉体的大小更不均匀，细胞质室中有较大的空隙（图1E，箭头）。N+34℃处理的细胞形态与26℃处理相似（图1F）。图像分析显示，34℃处理的细胞质室中淀粉体和蛋白体面积显著减少（图1G,H），导致空腔占垩白区25%以上（图1I）。相反，在N+34℃处理下造粉体和蛋白体类似于26℃处理，表明N供应可以改善细胞质空腔不足的现象(图1G-I)。在26℃处理时，大多数蛋白质储藏液泡在抽穗后20天时充满PBIIs（图2D），而在34℃处理时，蛋白质储藏液泡仍然停留在胞浆中，导致成熟时形成空气空间（图2E，H）。在相同的区域使用TEM观察每个处理抽穗后12、20和40天（图2）。在34℃处理的垩白区，少量位于亚糊粉层附近的细胞，对应于总垩白面积的3.4%，在抽穗后20天时除了蛋白质储藏液泡外，还保留了一些较大的溶解液泡。相比之下，在抽穗后40天时，N+34℃处理中PBII发育正常，PSVs很少或没有，与26℃处理类似（图2I）。各处理的籽粒含水量在灌浆期呈下降趋势，而34℃处理的成熟期水分含量较高(图2J-L)。
图1.水稻籽粒垩白区域的光显微观察。A-C：抽穗后40d不同热处理和氮处理下的籽粒横切面图像。D-F：光学显微镜下籽粒背侧外胚乳附近拍摄的图像，对应于(A-C)横切面上的红色方块。切片用考马斯亮蓝和碘化钾双染色。PB：蛋白体；am:造粉体。（E）箭头表示间隙区域(空气空间)。比例尺为50μm。G-I：外胚乳细胞中主要细胞器、淀粉质体、(H)PBs和(I)其他区域（间隙/空气空间）的面积百分比。
图2.水稻籽粒蛋白质体超微结构及含水量的变化。A-I：抽穗后12~40d(DAH)不同热处理和氮处理下胚乳外胚乳细胞TEM图。J-L：成熟期各处理籽粒含水量。SEM
SV,贮藏蛋白的液泡;PBIIs,来自蛋白质贮藏液泡(PSVs)中的不规则形状的蛋白体2-4μm，主要合成谷蛋白和球蛋白；PBI，位于内质网1-2μm，主要合成醇溶蛋白。
3.单个细胞的膨压
在核发育早期（12DAH）的单个细胞中，当psv在所有处理中定位相似时(图2A-C)，可以观察到OE细胞膨压率在处理之间的变化(图3B)。与26℃相比，34℃处理的细胞表现出相对较低的肿胀。N+34℃处理的细胞膨压率高于34℃处理，与26℃处理持平。
图3水稻籽粒垩白区域中细胞膨压和代谢物分析。A：果仁成熟早期（抽穗后12d）的背面横切面图像，包括用于从外层胚乳细胞提取汁液的压力探针示意图。在插入探针尖之前，将阴影部分的果皮去掉。DVB，背部维管束；a：糊粉层；oe：外层胚乳；p，果皮。比例尺为μm。B：箱体图显示了在抽穗后12天，每个热处理/氮处理的外胚乳细胞的膨压。C-E：不同处理的胚乳细胞在花后12天picoPPESI-MS负离子模式的质谱。
4.单个细胞中代谢物的鉴定
在初步实验中，我们观察到果皮(补充图S3)和OE细胞(图3CE)之间的代谢产物在组织间存在明显的差异。为了避免可能的污染，在将毛细血管尖端插入目标胚乳细胞之前，先将果核背面的一部分果皮组织去除(图3A)。当在受控环境下使用picoPPESI-MS直接分析细胞液时(补充图S1)，在负离子模式下鉴定出大量代谢物（主要是氨基酸、糖、有机酸和次生代谢物），与理论分子量值存在的差异(图3CE，补充表S3，补充图S4)。在26℃处理中，磷酸、苹果酸和谷氨酸和一些糖的质谱峰表明它们是主要离子。34℃处理的糖和氨基酸(包括谷氨酸)的信号强度普遍高于26℃处理。参与清除活性氧(ROS)的抗坏血酸和谷胱甘肽的信号强度在34℃处理时比在26℃时更高，这在典型的热反应中是可以预期的(图3D；补充表S3)。在34℃处理中观察到更多的Cys积累，形成二硫化物，而在26℃处理中没有检测到Cys相关信号(补充表S3)。在N+34℃处理中，Cys的信号较低且很少出现(频率为20%)，与Cys-糖簇离子的信号一致。蛋氨酸(Met)的的信号强度均小于Cys，不同处理间差异不明显。
5.热胁迫和增氮对蛋白质体发育的影响
高温胁迫下，籽粒蛋白质含量有增加的趋势。但由于粒重降低，N+34℃处理的每粒蛋白质含量与26℃时无差异。与26℃相比，34℃处理的PBs数量及其个体面积明显减少，N+34℃处理增加了PBs的数量和PBIIs的面积，但没有增加PBIs的面积。在34℃处理中，PBIs中cyr10p的表观面积增加，外层明显减少。在N+34℃处理中，PBIs中CysR10P的面积与34℃无差异，但高于26℃处理。34℃处理对谷蛋白前体和酸性谷蛋白亚基的，但在34℃处理中，CysR16P积累影响不大、13-kDaprolamins、α-球蛋白和碱性(β)-谷蛋白的含量下降(图4G)。34℃前施氮时，β-谷蛋白和CysR16P含量与26℃处理持平，高于34℃处理;在34℃处理中，CysR10P积累明显。
图4水稻籽粒垩白区域蛋白质体的图像分析结果。A：抽穗后40d各处理籽粒蛋白质含量。B：抽穗后40天时各处理籽粒蛋白质质量。C，D：外胚乳细胞中PBI和PBI的数量。E，F：同一细胞内的PBI和PBI的横截面积。E的插入图显示了位于PBI中心的富含cys的10-kDa层，与图上的阴影区域相对应。G：籽粒背侧三分之一处的SDS-PAGE分析，对应垩白区域。
结论
本研究发现了热诱导下细胞反应在代谢产物组成和细胞膨压方面的差异，进而导致细胞结构的空间变化，包括蛋白体形态。数据表明，热胁迫破坏了蛋白质合成，抑制了蛋白体的形成，同时部分抑制了淀粉体的发育，导致了垩白的出现。与此相反，含氮植物的细胞维持着蛋白体和淀粉体的发育，即使在高温下也能抑制垩白的形成。因此，在热诱导垩白粒的背侧外胚乳中，大的胞质蛋白质储藏液的保存和淀粉体的不充分积累都是导致空气空间形成的原因。研究结果也强调了调控蛋白质合成速率在热胁迫下优化水稻胚乳细胞器室隔过程中的重要作用。原文链接：
