上节介绍了电穿孔技术的原理和优势，本节接着介绍电穿孔技术的应用。
对于电穿孔技术的应用，主要还是建立在“此技术能使目标细胞的细胞膜产生一些微孔，从而方便将外源物质导入到细胞内”的基础之上。这些外源物质包括基因，包括蛋白分子，包括病毒，还包括一些药物。除此之外，电穿孔技术还可以用来促进细胞融合，以及将蛋白分子插入细胞膜等。
关于电穿孔技术的应用领域，我们重点介绍如下几个方面：
（一）基因治疗
对于因基因缺陷或基因异常引起的疾病，我们可以用电穿孔技术将外源基因导入病人体内适当的受体细胞，使得外源基因在受体细胞内表达出有功能的蛋白、或产出其他有用的物质，以实现病人体内原本缺失却必须的生理功能，从而使患这类疾病的病人们得到治疗。
（二）治疗肿瘤、癌症
用电场对肿瘤组织进行作用，促使肿瘤细胞膜出现穿孔，可以降低肿瘤细胞膜对化学药物的屏蔽作用，从而提高抗癌药物对肿瘤细胞的毒性，达到减小化疗副作用，提高治疗效果的目的（如下图1所示）。有实验证明：用同样剂量的博莱酶素结合电穿孔技术使用来治疗肿瘤，治疗效果要比单纯的博来霉素治疗高7倍左右。
（三）经皮给药
将高短电脉冲作用在皮肤上，使得皮肤产生可逆性孔道，药物通过该孔道进入到皮下，可以大大提高药物的经皮渗透速率。此技术对大分子药物，特别是多肽和蛋白质的经皮给药具有很大的应用潜力。
（四）应用在DNA疫苗接种上
通常认为：DNA疫苗用于比老鼠大的动物，没有什么预防疾病的效果。效果不佳的一个原因可能是：DNA疫苗进入细胞的效率太低！有科学家尝试利用电穿孔技术使细胞膜产生膜孔，来使更多的DNA疫苗进入细胞，并实施了相关的实验。实验结果表明：电穿孔技术的使用，确实使得更多的DNA疫苗进入细胞、以致更多的疫苗蛋白在细胞中被表达出来；而这些蛋白又可以激发动物体的免疫系统产出保护物质，用于将来动物体对抗病原体的入侵。这就使得DNA疫苗为大的动物（包括人）预防疾病成为可能。
（五）用于饮用水的消毒
目前电穿孔技术还应用于饮用水消毒系统，因为电穿孔能使原生动物膜和细菌细胞膜瞬时穿孔，通过不可逆电穿孔直接杀死细胞，或者通过产生的膜孔促进消毒剂更多地进入细胞、发挥其杀灭细胞的作用，从而可以降低消毒剂的使用剂量。
（六）提高CRISPR/Cas9系统工作的效率
CRISPR/Cas9系统在细胞里面工作，可以精确高效地对细胞的基因组进行改造。如将CRISPR/Cas9系统导入小鼠受精卵，就可以制造出携带单一突变、多种因突变、或其它遗传修饰的工程化小鼠。以前将CRISPR/Cas9系统导入细胞通常用的是显微注射法，而这种方法法对实验条件要求较高、且实验过程非常耗时。
如果我们利用电穿孔技术增加细胞膜的可透性，来帮助CRISPR/Cas9系统导入小鼠受精卵，就可以高效快速地替代显微注射，使CRISPR/Cas9系统能高效且高通量地对小鼠受精卵进行基因改造。原先的显微注射法一次只能对一个受精卵进行操作，而电穿孔技术一次可以对20至50个受精卵进行操作。这就大大提高了CRISPR/Cas9系统工作的效率。上述介绍的是电穿孔技术的应用领域。在具体应用过程中，由于生物细胞的多样性，其大小、物理化学特性以及所在环境各不相同，对于不同类型的细胞进行电穿孔，所选择的各种实验条件实验参数也是不相同的。现在我们就来介绍一下影响电穿孔技术应用的多种因素：
1，电脉冲幅度对电穿孔的影响
国外有研究表明，细胞电穿孔的最低电磁脉冲强度在～V／cm，低于这个强度，细胞不能被电穿孔。随着电磁脉冲强度的增加，电穿孔的效率提高，但并不成正比例，当场强达到一定值时，细胞的穿孔率不在增加。同时，当电磁脉冲强度达到一定值以后，随着电磁脉冲强度的增加，细胞的死亡率增加，当达到～V／cm以上时，细胞的死亡率显著增加。
2，电脉冲宽度对电穿孔的影响
一般说来有以下规律认识：脉冲宽度的下限必须比细胞膜充电的时间和膜的弹性恢复时间长，才能保持孔洞的开放。脉冲宽度和幅度之间存在互补关系，降低脉冲幅度，则需要加宽脉冲宽度来弥补，穿孔的效率往往和脉冲幅度与宽度的乘积成正比。
3，电脉冲个数对电穿孔的影响
脉冲次数一般在3～11个之间，增加脉冲个数能提高细胞电穿孔的效率。但是，当达到一定的脉冲个数时，穿孔几率不再增加。
4，电脉冲波形对电穿孔的影响
不同波形对细胞电穿孔也有重要的影响，目前用的最多的是直流方波脉冲和指数衰减的RC脉冲。研究表明，如果电穿孔脉冲在峰值电压击穿细胞膜后，能以较低的电压维持细胞膜孔洞开放一段时间，则有利于提高细胞电穿孔的效率，RC脉冲往往比相同幅度的直流脉冲更有效。RC脉冲更容易制造，效果较好，所以用得最广。
5，胶体渗透压和细胞膨胀对电穿孔的影响
细胞被电脉冲击穿之后，水与一些离子可以自由进入，但大分子却不容易通过击穿的小孔。由于渗透压的不平衡，水和部分离子及小分子会进入细胞，导致细胞继续膨胀而破裂，除非细胞膜在破裂前就复原。如果要避免细胞破裂，往往需要在细胞外的缓冲液中加入大分子(如糖类)以维持渗透压平衡。
在很多情况下，允许细胞稍微膨胀，会有助于引导药物和分子进入细胞，当水或缓冲液进入细胞时，会把孔道扩大，同时溶在缓冲液中的成分会随水流被带进细胞。所以一般在穿孔之前，把细胞放入稍低渗透压的缓冲液中，让细胞略微膨胀，细胞膜的张力也因而增高，横向张力可以帮助电压力穿破细胞膜。
6,其他因素对电穿孔的影响
（1）细胞壁对电穿孔效率有影响：许多学者采用酵母作实验材料，研究发现，处于对数生长期的酵母细胞其转化率高于处于稳定期的酵母细胞吲。这是因为处于对数生长期的酵母细胞生命力旺盛，细胞壁不如处于稳定期的细胞壁致密。去壁酵母原生质体比完整的酵母细胞更容易穿孔，所需电脉冲的强度和脉冲宽度都比完整酵母细胞小。酵母细胞壁的存在，对质膜的电击穿有极大的影响。而细胞壁的形成则随细胞种类、生长期的不同而有很大差别。细胞壁对膜击穿电压的影响可能与链霉蛋白酶等提高对电场的抗性作用类似，即由于它们的存在改变了膜的带电情况，要弄清这一机制，有待进一步的实验证明。
（2）生长期及生长速率均影响电穿孔的效率:生长快的细胞比生长慢的细胞电穿孔效率高；细胞处于有丝分裂期时更容易穿孔。
（3）细胞的大小也能影响电穿孔:一般情况下细胞越大，实现电穿孔所需要的电压越小：细胞越小，实现电穿孔所需要的电压越高。
（4）缓冲液的选择也能影响电穿孔：在电穿孔时，往往需要使用某种缓冲液。常用的电击缓冲液一般分为三类,第一种是细胞培养基，如DMEM、DMEM／F12、RPMll、培养基等；第二种是磷酸盐类缓冲液，如PBS、K-PBS、HBS、HeBS等；第三种为人工配制的与细胞内外环境相似的缓冲液，如等渗低电导液、cytomix电击缓冲液等。
研究发现:在第一、二类缓冲液中电击Namalwa细胞(为悬浮细胞)很难穿孔，而在cytomix缓冲液中能有效穿孔，其平均转染率为1.42%；而且cytomix缓冲液能极大的提高贴壁细胞Vero的转染率，还能有效转染在其它缓冲液中不易转染的半悬浮细胞Sp2/0。这可能是因为cytomix缓冲液的组成与细胞内离子成分非常相似。对比电击缓冲液PBS和完全培养基，cytomix缓冲液中的Ca2+、Mf+浓度低，用EGTA代替常用的EDTA，缓冲液PH值、K+浓度高，Na+浓度非常低，该缓冲液极大的模拟了真核细胞内的离子环境。cytomix中的ATP和谷氨酞胺能阻止穿孔时细胞质成分渗漏，保护细胞膜抗氧化作用，有利于孔洞的重新闭合。
（5）一些生物活性因子对电穿孔也有影响:用不同的蛋白酶处理细胞会影响细胞的电穿孔效率.研究发现:用链霉蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶Ⅳ处理酵母细胞原生质体后再电击处理，发现链霉蛋白酶，胰蛋白酶能显著提高原生质体对电磁脉冲的抗性，而加胰蛋白酶Ⅳ处理，对原生质体再生菌落数的影响并不显著。
本章对于电穿孔技术的介绍就到此结束，希望能对读者们学习和工作中的科学设计和工程设计有所帮助。在下一章中，我们将为读者们带来更多精彩，敬请
参考文献：
1，《细胞电穿孔技术的研究》，作者：孙云，徐宝强；《中国民航大学硕士学位论文》，。
