谷氨酸合成酶(GOGAT)活性检测试剂盒(紫外分光光度法)
注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
产品货号:BA
产品规格:50管/48样
产品简介:
GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中,和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成GS/GOGAT循环,参与氨同化的调控。
GOGAT以NADH为电子供体,催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸,NADH在nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
产品内容:
提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体60mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×2支,4℃保存;
试剂三:粉剂×2支,4℃保存;
试剂四:粉剂×2支,-20℃保存。
工作液的配制:取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入30mL试剂一中溶解。现用现配。可分装后-20℃保存,避免反复冻融。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(个):提取液体积(mL)为~:1的比例(建议万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或W,超声3s,间隔10s,重复30次);0g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。0g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤:
1、紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至nm,光度计蒸馏水调零。
2、工作液提前配置,平衡至室温。
3、样本测定:
三、GOGAT活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(V样×Cpr)÷T=.5×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(W×V样÷V样总)÷T=.5×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT(U/cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×]÷(×V样÷V样总)÷T=0.×ΔA
V反总:反应体系总体积,10-3L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;:细菌或细胞总数,万。
注意事项:
1、测定期间样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
3、当A1大于1.5或者ΔA大于0.6时,建议将样品用蒸馏水稀释后测定,当ΔA过小时,可以延长酶促反应时间(10min或15min)或者加大加入的样品体积进行测量。
4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。