米糠蛋白是一种混合蛋白，根据Osborne分级，可分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。清蛋白是米糠蛋白中含量最高（达24%～43%）的组分，由于分子表面带有足够的静电荷并且鲜有S—S交联或聚集，是维持米糠蛋白界面性质的主要贡献者。近年来，研究发现米糠清蛋白还具有非常好的抗氧化性和降血糖活性，可作为功能因子或活性成分载体应用于特医食品或医药领域。然而，全球每年90%的米糠都被直接用作畜禽饲料，综合利用水平较低，严重限制了米糠蛋白等资源的深度开发和利用。造成米糠资源综合利用水平较低的重要原因是新鲜米糠极易酸败变质。米糠酸败过程中蛋白质的结构变化除了会影响其营养价值，必然还会影响其界面性质的发挥，但目前国内外鲜有关于米糠酸败影响米糠蛋白及其主要组分界面性质的深入研究。
因此，稻谷及副产物深加工国家工程实验室、中南林业科技大学食品科学与工程学院的吴晓娟和吴伟*通过分析米糠贮藏过程中米糠清蛋白氧化程度和结构特征的变化，并将这些变化与米糠清蛋白的界面性质进行相关性分析，从蛋白质氧化角度剖析米糠酸败对米糠清蛋白界面性质的影响，为开发和应用米糠蛋白资源提供理论参考。
1米糠酸败对米糠清蛋白氧化程度的影响
羰基、游离巯基和二硫键含量是衡量各种来源蛋白氧化程度的通用指标。结果显示，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白羰基含量逐渐增加，游离巯基含量逐渐减少，二硫键含量则先增加后减少。将米糠清蛋白氧化程度与米糠酸败程度进行相关性分析，米糠清蛋白羰基含量与米糠酸值和过氧化值呈显著（P＜0.05）正相关，与丙二醛含量呈极显著（P＜0.01）正相关；游离巯基含量与米糠酸值和过氧化值呈显著（P＜0.05）负相关，与丙二醛含量呈极显著（P＜0.01）负相关。
相比于羰基和游离巯基含量，米糠清蛋白二硫键含量与米糠过氧化值和丙二醛含量的相关性不显著，这可能是由于巯基氧化是一个极其复杂的过程。游离巯基通常先与自由基反应生成亚磺酰自由基，再与分子氧结合形成硫醇自由基，然后继续氧化形成二硫键，而二硫键又可以进一步氧化生成亚磺酸、磺酸等，这就导致清蛋白的二硫键含量随着米糠酸败程度的增加呈现先增后减的趋势。总的来说，米糠酸败过程中清蛋白的氧化修饰主要是由脂质氧化产物诱导发生的，并且次级氧化产物活性醛类在这一过程中发挥了重要作用。
2米糠酸败对米糠清蛋白氧化聚集和交联行为的影响
如图1A所示，新鲜米糠在波长nm处有2个强吸收峰和1个弱吸收峰，对应的保留时间分别为12.05、11.33min和5.6min，前者主要是米糠蛋白及其亚基等小分子物质产生的特征吸收峰，后者是少量天然的米糠蛋白聚集体产生的特征吸收峰。由图1B可知，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白聚集体对应的峰面积百分比逐渐增加（由1.04%增加到3.91%），表明米糠氧化酸败产物诱导清蛋白发生了氧化聚集。保留时间12.05min的峰面积百分比先减小后增加，11.33min的峰面积百分比先增加后减少，均在贮藏时间第5天达到极值，表明米糠酸败过程中清蛋白发生氧化聚集的同时还伴随少量氧化分解。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳是分析蛋白质亚基结构的主要方法，也是表征蛋白质氧化交联的重要手段。如图1C所示，新鲜米糠制备的清蛋白亚基主要分布在15～20、24、40～50ku和60ku，另外在22ku和37ku还有极浅的条带，这应该是少量残余谷蛋白的碱性亚基和酸性亚基。随着米糠酸败程度的增加，分离胶顶部颜色逐渐加深，表明米糠氧化酸败产物诱导清蛋白发生了氧化交联。米糠贮藏第10天时，24ku和60ku附近的条带也明显加深，同样表明清蛋白发生了一定程度的氧化分解，形成新的多肽片断。结合前面巯基氧化的结果推断，二硫键和非二硫键共同参与了米糠酸败过程中清蛋白的氧化交联反应，由于巯基氧化形成二硫键的过程是可逆反应，二硫键共价交联的聚集体可能会部分降解。
3米糠酸败对米糠清蛋白空间结构的影响
3.1傅里叶变换红外光谱分析
蛋白质的二级结构组成与酰胺I带（～cm-1）的振动频率密切相关。随着米糠贮藏时间延长，氨基酸侧链、β-折叠结构和β-转角结构对应的特征吸收峰都发生了红移，并且在cm-1产生新的特征吸收峰，这一特征吸收峰通常被认为是随机结构产生的。
如图2B所示，新鲜米糠制备的清蛋白中α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲和氨基酸侧链的占比分别为20.09%、45.13%、18.93%、14.24%和1.62%。随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的α-螺旋、β-折叠、β-转角含量逐渐减少，无规卷曲和氨基酸侧链含量增加。当贮藏第10天，米糠清蛋白中α-螺旋、β-折叠、β-转角相对含量分别减少到17.49%、38.24%、14.88%，而无规卷曲和氨基酸侧链相对含量分别增加到27.41%和1.98%。不同酸败程度米糠制备的清蛋白α-螺旋/β-折叠分别为0.、0.、0.、0.和0.，表明米糠酸败过程中清蛋白的柔韧性逐渐降低，结构变得更加致密，这可能也与蛋白质氧化交联和聚集有关。
3.2荧光光谱分析
如图3A所示，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的内源荧光强度显著（P＜0.05）下降，这是因为色氨酸残基具有较低的单电子氧化势能，极易被自由基等氧化形成犬尿氨酸，产生荧光猝灭现象。随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的最大荧光峰位蓝移，从nm蓝移到nm，表明米糠清蛋白中色氨酸残基微环境的非极性增强，结合前面液相色谱和凝胶电泳结果推断，这应该是带有色氨酸残基的部分疏水性侧链被脂质氧化产物诱导形成了结构致密的聚集体，从而避开外部极性环境造成的。如图3B所示，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的表面疏水性显著（P＜0.05）下降。
4米糠酸败对米糠清蛋白界面性质的影响
4.1米糠酸败对米糠清蛋白溶解度和Zeta电位的影响
如图4A所示，在pH7.0条件下，新鲜米糠制备的清蛋白溶解度为64.0%，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的溶解性逐渐下降，表明米糠氧化酸败产物还会诱导米糠清蛋白产生不溶性的氧化聚集体。如图4B所示，在pH7.0条件下，米糠清蛋白羧基去质子化，使蛋白质分子表面带负电荷。新鲜米糠制备的清蛋白溶液Zeta电位绝对值为11mV，通过负的静电斥力使蛋白质溶液体系稳定。随着米糠贮藏时间延长，Zeta电位绝对值显著（P＜0.05）降低，结合前面研究结果推断，这可能是因为氧化交联形成的可溶性和不溶性聚集体阻碍了蛋白质羧基解离，从而使蛋白质分子间的静电斥力减弱。
4.2米糠酸败对米糠清蛋白乳化性质和起泡性质的影响
如图5A、B所示，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的乳化性和乳化稳定性均呈现逐渐下降的趋势，乳化性由65.20m2/g下降到50.10m2/g，乳化稳定性由8.77min下降到5.05min。目前大量研究已证实，较高浓度的羟基自由基、过氧自由基等自由基类氧化剂会导致蛋白质的乳化性质下降，较高浓度的13-氢过氧化十八碳二烯酸也会导致谷物蛋白的乳化性和乳化稳定性下降，并认为是由于氧化聚集行为使蛋白质的溶解性、持水性、持油性下降所致。可见，米糠酸败过程中清蛋白乳化性和乳化稳定性的下降是脂质氢过氧化物、自由基等氧化剂协同作用的结果。
米糠蛋白的起泡性取决于蛋白质分子在气-液界面通过构象变化和分子间作用力快速形成黏弹性蛋白膜的能力，起泡稳定性则取决于已形成的稳定蛋白膜抵抗重力和机械应力的能力。如图5C、D所示，随着米糠贮藏时间延长，米糠清蛋白的起泡能力和起泡稳定性均呈现逐渐下降的趋势，起泡能力由55.84%下降到39.90%，起泡稳定性由67.80%下降到53.50%。
4.3米糠清蛋白氧化程度、结构特征、界面性质之间的相关性分析
通过对米糠清蛋白氧化程度、结构特征和界面性质之间进行相关性分析，进一步探索米糠酸败诱导的氧化修饰对米糠清蛋白界面性质的影响。结果显示，米糠清蛋白的乳化性、乳化稳定性、起泡能力和起泡稳定性与其羰基含量、α-螺旋/β-折叠呈极显著（P＜0.01）负相关，与游离巯基含量、表面疏水性、Zeta电位绝对值、溶解度呈极显著（P＜0.01）正相关。α-螺旋/β-折叠反映了蛋白质分子的柔性程度，而柔性对蛋白质的界面性质具有显著影响。
Zeta电位是维持蛋白质胶体分散体系稳定性的主要因素。米糠酸败过程中米糠清蛋白的氧化交联或聚集降低了蛋白质分子的柔性和表面疏水性，并导致蛋白溶液Zeta电位下降，在这些变化的共同影响下，米糠清蛋白的界面性质持续下降。
结论
米糠酸败会诱导米糠清蛋白发生羰基化和巯基氧化反应。通过对米糠清蛋白氧化程度和米糠酸败程度之间进行相关性分析发现，米糠清蛋白的氧化修饰主要是由脂质氧化产物诱导发生的，并且次级氧化产物活性醛类在这一过程中发挥了重要作用。米糠酸败过程中，米糠清蛋白会通过二硫键和非二硫共价键交联形成可溶性的氧化聚集体，在氧化交联的同时还伴随少量氧化分解。米糠酸败诱导的蛋白质氧化会促使米糠清蛋白的空间结构发生复杂变化，主要表现为二级结构中的α-螺旋、β-折叠、β-转角含量减少，无规卷曲和氨基酸侧链含量增加，同时维持蛋白质三级结构稳定性的疏水作用力减弱。米糠清蛋白的结构变化会极大地影响其界面性质。随着米糠酸败程度增加，米糠清蛋白溶液的Zeta电位和蛋白质溶解度下降，乳化性、乳化稳定性、起泡能力和起泡稳定性等界面性质也随之下降。总的来说，米糠氧化酸败产物诱导米糠清蛋白通过蛋白质-蛋白质相互作用（二硫键、非二硫共价键、疏水作用力等）形成可溶性和不可溶的聚集体，导致蛋白质分子柔性和表面疏水性下降，分子间静电斥力减弱，进而对米糠清蛋白的界面性质产生负面影响。
本文《米糠酸败诱导的蛋白质氧化对米糠清蛋白界面性质的影响》来源于《食品科学》年42卷6期8-15页，作者：吴晓娟，吴伟。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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