小麦品种分子鉴定技术研究进展 [复制链接]

北京市农林科学院小麦所庞斌双各位老师好！我是北京市农林科学院小麦所的庞斌双，很荣幸成为“一麦众承”大家庭的一员，受组长丁明亮老师安排，我代表25号组“众人育麦”值日。本组成员12人，组长丁明亮，组员有庞斌双、张容老师、雷格丽老师、万映秀老师、刘志勇老师、陈春环老师、王中兴老师、王道文老师、任根深老师、王伟老师和任勇老师。衷心感谢陈红敏老师搭建“一麦众承”小麦研讨大平台，凝聚了全国小麦育种、栽培、植保、推广、生产和应用等全产业链的大咖，为国家和区域小麦粮食安全做出了巨大贡献，本人也在研讨中收获颇丰、受益匪浅。本人科研历经春麦远缘杂交育种、冬麦品质育种以及小麦品种鉴定技术开发与利用研究。搭建了农作物规模化SSR标记和SNP标记基因分型平台，制定了《主要农作物品种真实性SSR分子标记检测普通小麦》（NY/T-）、《普通小麦品种纯度鉴定SSR分子标记法》（NY/T-）、《小麦品种真实性鉴定SNP标记法》（NY/T-）等标准，开发了用于小麦品种分子鉴定的BAAF-wheat-90KSNP芯片，构建了我国已审小麦品种标准样品SSR-和SNP-DNA指纹数据库以及我国新品种保护标准样品的SNP-DNA指纹数据库。基本掌握了我国小麦已审品种、新品种保护样品以及每年参加小麦区域试验参试品系的遗传基础。本人利用业余时间查阅大量文献，依据规模化DNA指纹检测平台优势，建立了目前对白粉病、条锈病、叶锈病有效的抗病基因快速鉴定技术体系（SSR标记、SNP标记），并结合国际上已发表的功能基因SNP标记，对我国已审品种进行了全部基因型扫描，全方位了解了我国小麦育种现状和动态。因篇幅有限，下面我把以前从事的品质育种的心得、体会以及我国小麦育种现状大致情况进行简单的介绍，希望能够为育种工作提供思路和依据，所有内容仅代表个人观点，不妥之处还请大家批评指正！1品质育种的心得和体会利用回交转育方法，将多种高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）基因分别转育到中强筋小麦品种小偃54和中偏弱筋品种偃展1号背景中（见图1偃展1号的示例），回交5-6代后与轮回亲本田间表型基本一致。两年多点种植的品质测试结果表明，优质的HMW-GS组合在不同的遗传背景下作用效果不同，HMW-GS基因表达的数量与面筋强弱没有固定的规律，个别基因沉默却因为HMW-GS基因的表达具有互补效应并没有达到预期弱筋的效果，但是可以通过打破HMW-GS中x-tye和y-type亚基的平衡来培育弱筋品种。

1.1不同HMW-GS在中强筋品种小偃54背景下的品质表现不同HMW-GS在小偃54（1，14+15，2+12）遗传背景下的品质表现见表1，编号1为轮回亲本小偃54，从各项品质指标反馈的结果显示，在所有HMW-GS组合类型中，编号4品系的组合类型（1，7+8，5+10）品质指标最好，其稳定时间、面筋指数、SDS-沉淀值、形成时间比小偃54均极显著提高，其中稳定时间提高11.02分钟，面筋指数提高18%，SDS-沉淀值提高11.92，说明在表中所有的组合类型中“1，7+8，5+10”组合类型是强筋品质育种的最佳组合类型。在Glu-B1位点：编号2品系用“7”亚基替换了小偃54的“14+15”亚基后，稳定时间和形成时间略有降低，不显著，面筋指数和SDS-沉淀值略有上升，不显著；编号3品系用“7+9”亚基替换了小偃54的“14+15”亚基后，稳定时间提高了2.85分钟，达到极显著水平，对其他品质指标的影响不显著；编号4和编号6品系相比，编号4品系用“7+8”亚基替换了编号6品系的“14+15”亚基后，稳定时间提高了5.46分钟，形成时间提高了4.17分钟，二者均达到极显著水平，面筋指数提高4.99%，达到显著水平，SDS-沉淀值提高6.25，未达显著水平。在Glu-D1位点：编号6品系用“5+10”亚基替换了小偃54的“2+12”亚基后，稳定时间提高了5.56分钟，面筋指数提高13%，SDS-沉淀值提高11.92，形成时间提高了3.39分钟，均达到极显著水平；编号2和编号5品系相比，编号5品系用“5+10”亚基替换了编号2品系的“2+12”亚基后，稳定时间提高了10分钟，面筋指数提高10.5%，SDS-沉淀值提高11.92，形成时间提高了6.17分钟，均达到极显著水平。通过以上结果显示，在中强筋的小麦遗传背景中，在Glu-D1位点中5+10亚基能够急剧提高面团的稳定时间、形成时间、面筋指数和SDS-沉淀值，但是与不同位点的HMW-GS组合不同，其影响大小不同，在本实验中适合强筋的最优组合类型为“1，7+8，5+10”。在Glu-B1位点，“7+8”亚基对稳定时间、形成时间和面筋指数显著提高，对SDS-沉淀值有提高但未达显著水平；“7+9”亚基能够极显著提高面团的稳定时间，对其他品质指标影响不显著。表1小偃54背景下HMW-GS近等基因系品质表现

1.2不同HMW-GS在中偏弱筋品种偃展1号背景下的品质表现不同HMW-GS在偃展1号（14+15，4+12）遗传背景下的品质表现见表2，编号7为轮回亲本偃展1号，从各项品质指标反馈的结果显示，在所有HMW-GS组合类型中，因偃展1号为中偏弱筋品种，在Glu-A1位点和Glu-D1位点分别导入“1”号亚基和“5+10”亚基时，个别品系极显著提高了稳定时间等品质指标，但提高幅度远没有达到小偃54背景下品质指标的提高幅度，甚至部分品系反倒起了反作用如编号5因为“1”的导入使品质指标急剧下降，帮了倒忙，说明Glu-1三个位点表达的亚基组合之间存在某种平衡，强筋和弱筋育种对HMW-GS组合类型的需求不同，并不是传统意义上表达的HMW-GS数量越多或越少越有利于强筋或弱筋品质育种。在Glu-A1位点：编号1和编号3，编号6和编号7，编号9和编号10，编号11和编号12等的品质结果表明，多数品系导入“1”亚基有利于各种品质指标的提高，但个别品系因为HMW-GS组合类型的不同对个别指标反而有反作用，如编号1（14+15，5+10）和编号3（1，14+15，5+10）。在Glu-B1位点：编号2品系用“7+9”亚基替换了编号1品系的“14+15”亚基后，SDS-沉淀值显著提高，达到极显著水平，面筋指数和形成时间显著提高，达到显著水平，稳定时间略有上升，不显著；编号5品系的“8*”亚基替换了编号8品系“7”亚基后，稳定时间、SDS-沉淀值、面筋指数、形成时间显著下降，达到极显著水平，说明“8*”亚基是未来弱筋小麦育种的重要基因资源，在编号4品系尽管导入了“1”和“5+10”亚基，也很难抵消“8*”亚基对弱筋影响的重要作用。编号11品系的“7+8*”亚基替换了编号10品系“14+15”亚基后，稳定时间、面筋指数、SDS-沉淀值显著提高，达到显著水平。在Glu-D1位点：在Glu-A1位点有“1”号亚基基因存在时，如编号6和编号10品系品质指标显示，“2.2+12”比“4+12”更有利于弱筋品质的提升，在Glu-A1位点为“null”基因时，如编号7和编号9品系的品质结果，“4+12”比“2.2+12”有利于弱筋小麦品质提升，其他品质指标接近；从编号3和6品系的品质指标比较结果看，在已经具有“1”和“14+15”的基础上，“5+10”与“4+12”的贡献各有优势，“5+10”有利于稳定时间的提高，但“4+12”在SDS-沉淀值、面筋指数和形成时间指标上显著优于“5+10”，达到极显著或显著水平；从编号1-4的四个品系可以看出，没有导入1号亚基的编号1和2，“5+10”对品质的改善非常显著，但存在“5+10”后，再导入“1”号亚基后如品系3和4，却使各项品质指标急剧下降，说明骨干亲本的遗传背景和不同HMW-GS组合类型两者对品质的影响非常巨大。表2偃展1号背景下HMW-GS近等基因系品质表现

1.3品质育种的思考以上两个遗传背景的HMW-GS近等基因系的品质测试结果表明，品质育种是个非常复杂的系统工程，低分子量麦谷蛋白亚基、醇溶蛋白、淀粉等基因都或多或少参与并影响了面粉的加工品质，因此骨干亲本本底遗传背景的选择是品质育种成败的关键，选择好的亲本可以起到事半功倍的效果。在强筋小麦育种中，个人感觉要选择至少中强筋以上的骨干亲本为本底品种，在Glu-A1位点导入“1”或“2*”亚基基因，Glu-B1位点导入“7+8”或“7OX+8”（图2）亚基基因，Glu-D1位点导入“5+10”亚基基因是强筋小麦育种的有效策略，期间可以根据品质指标的要求对HMW-GS组成进行适当微调。在弱筋小麦品质育种中还需要做更深入的研究，比强筋小麦育种难度要大，根据本实验结果个人建议在Glu-A1位点导入“1”号亚基基因，Glu-B1位点导入“8*”亚基基因，Glu-D1位点导入“2.2+12”或“4+12”亚基基因将有利于弱筋小麦品种的培育，至于仅含有“8*，4+12”或“8*，2.2+12”的品质指标会否成为弱筋小麦育种的策略，还需要看后续小麦所的后续进一步的进展和品质测试结果。

图1A：云麦33中过量表达的7ox亚基基因；B：过量表达1Bx7ox基因的启动子驱动GUS过量表达2我国小麦遗传育种现状分析2.1已审小麦品种近似品种现状依据主要农作物品种真实性SSR分子标记检测普通小麦》（NY/T-）的42个SSR位点构建了审定小麦标准样品的SSR指纹。指纹数据分析结果显示，所有标准样品中无差异的标准样品99份，有1个差异位点的标准样品86份，有2个差异位点的标准样品份，有3个差异位点的标准样品份，有4个差异位点的标准样品份，统计涉及0-4个差异位点的标准样品总计份。0到4个差异位点的标准样品占比见图2，从图2的数据可以看出，差异位点为2的审定小麦标准样品占比最高达到13.6%，3和4个差异位点的标准样品占比稍低，0-4个差异位点的样品总数占比达到49.49%，接近50%，可见我国审定小麦标准样品的遗传背景非常狭窄，小麦种业的育种创新力不足，过度集中使用少数骨干亲本是造成遗传背景狭窄的主因。

图2审定品种中筛查的近似品种占比注：0：42个位点中无差异位点的样品占比；1：差异位点为1的样品占比；2：差异位点为2的样品占比；3：差异位点为3的样品占比；4：差异位点为4的样品占比；0-4：差异位点为0-4个位点的样品占比。2.2已审小麦品种DNA位点纯合率现状多年科学研究结果表明，系统选育方法选育的小麦6代新品系DNA位点纯合率平均为95.5%以上，即在42个位点中最多有2个分离位点。分析审定小麦标准样品DNA指纹数据显示，DNA位点纯合率在95%以上的样品占比仅为66%左右（图3）。DNA位点纯合率低的参试品种性状肯定存在分离，其他育种家通过提纯复壮方法很容易从中选出新品种，如图4的示例，SB是标准样品烟农24号，而J18-样品为监督抽查样品，通过指纹数据大家可以明显看出，J18-是从烟农24号提纯复壮的样品，在WP03、WP15、WP18、WP22、WP35等5个位点上分别携带了标准样品2个等位变异的1个。此种案例不胜枚举。在此也提醒育种者有创新性的优良品种如果想取得新品种权并希望彻底得到保护，一定要把控好DNA位点纯合率，确保别人无法提纯复壮。DNA位点纯合率低不利于原始品种权的保护，也给品种鉴定、市场监管和司法鉴定带来很多困难，毕竟小麦品种指纹是群体指纹合力表现的结果，用系谱方法选育出来的品种中，很难找到全基因组水平完全相同的个体，跟人和动物等杂合个体指纹的表现完全不同，因此为了保护育种者的新品种权，建议小麦品种高世代参试，或者从第4代开始监控42个SSR位点或96个SNP位点的纯合情况。

图3标准样品的分离DNA位点分布

图4分离DNA位点的知识产权纠纷示例

2.3历年国家区试参试品系近似品种筛查情况国家区域试验特异性鉴定一直采用遗传相似系数为90%的阈值，即与已知品种遗传相似系数小于90%（42个位点中差异位点数4个以上）的参试品种，具备特异性，而与已知品种遗传相似系数大于90%（42个位点中差异位点数4个以下）的品种，可能不具备特异性，需要通过田间相邻种植鉴定。本人分析汇总了-年国家区域试验参试样品的近似品种筛查情况（表3和图5）。11年DNA检测的参试样品总数为份，进行特异性鉴定的样本数份，筛查出有近似品种的参试品种数为份，占比13.8%。年度间差异较大。年筛查近似品种数最多，占比20.54%，以后呈现逐年降低趋势，年降到最低9.57%。说明国家区域试验的参试品种数量呈现显著增长，参试品种的质量得到大幅度提升，DNA指纹监控作用凸显。表3-年国家小麦区域试验参试样品筛查出与已审定品种近似的样品数

图5近似品种占比随年份变化趋势2.4小麦近似品种多的成因分析2.4.1审定品种标准样品库本身从源头上近似品种多审定小麦品种的标准样品是我国小麦市场监管和国家区域试验特异性鉴定的基础和保障。由于早期没有引入DNA指纹检测技术，区试审定前未进行特异性和真实性质控，部分不具备特异性的品种或重复审定的品种通过审定，造成我国审定品种的标准样品近似或指纹相同样品偏多，给后期区试小麦品种特异性鉴定和市场监管带来巨大挑战。2.4.2国家、省市级区试、各种联合体等区试质控和审定缺乏联动统一国家审定小麦标准样品中有些品种有2个以上标准样品，有国家级审定标准样品，有省市级审定标准样品，个别还有引种后改名字的标准样品，且部分同名标准样品指纹不一致。出现此种现象的原因是大部分省市级区域试验并未纳入DNA指纹监控技术，目前小麦DNA指纹监控技术仅在国家、北京、河南、河北、江苏、湖北、山西、陕西、重庆、天津、四川等省市、良种攻关、联合体等区域试验中应用。还没有形成联动机制，DNA指纹质控范围仅限于审定品种和本级参试品种范围内，缺乏全国范围内统一指纹比对监控，因此造成同品不同名，同名指纹不一致现象仍然存在，给审定小麦标准的规范化管理、监督抽查、区试质控等造成没有必要的麻烦。小麦是异源六倍体作物，随着育种世代的增加和育种家不断的提纯复壮，分离DNA位点会逐渐减少，纯合DNA位点逐渐增加，早期审定的标准样品和后期审定的标准样品DNA指纹会发生变化。因此建议国家级、省市级等提交的标准样品应该分级提交和保存。建议加大其他省市级小麦区试DNA指纹检测力度和覆盖面，建立各级区试联动统一质控体系，保证优良品种通过审定。2.4.3标准样品提取和DNA指纹建库相对滞后标准样品由种业司统一管理，样品储存在国家种质库，由于样品管理涉及部门多，经费紧张，也由于疫情等原因，导致从年至今一直没有申请到新增标准样品，因此近几年区试特异性质控不能与时俱进，最终会有部分不具备特异性等特性的品种通过审定。2.4.4区试参试品种缺乏EDV审定标准因已审品种指纹相同或相近品种较多，造成每年区试参试品种筛查出近似品种较多，整理近几年的区域试验近似筛查结果，发现山西、河北、山东、河南参试的小部分品种主要与表4的品种形成相似群，如以烟农19号为代表的相似群1，以沧麦为代表的相似群2，以良星系列为代表的相似群3，以周麦16为代表的相似群4，以及以周麦22为代表的相似群5等等，每个相似群涉及的品种均列在表中。反映出育种单位过渡单一使用少数骨干亲本现象严重，建议加快建立EDV品种的审定标准，保护优良品种的知识产权，提升育种者创新意识，从制度上遏制品种抄袭或修饰现象，鼓励原始创新。

表4近几年区试品种涉及已知品种的主要相似群

3个人建议3.1加大种质资源外引力度，提高我国农作物遗传资源多样性种质资源是国家粮食安全和提高我国种业核心竞争力的基础。年有幸跟农村部领导去日本培训考察，发现日本80%以上的资源都来源于海外，而我国资源库90%的资源都来源于国内。很明显我国收集和外引资源的意识不强，创新动力不足，我们每一个育种人都应该有居安思危意识，有责任和义务利用并创造一切机会收集更多的国外农作物遗传资源，加大外引资源的鉴定评价力度，丰富我国农作物资源多样性，提高我国品种创新活力，为国家粮食安全和民族种业振兴贡献一份自己的力量。3.2做大做强分子设计育种，提高精准育种效率分子设计育种是非常高效的育种方法，在品质育种、抗病育种等领域发挥了巨大作用，如育成的强筋品种师栾02-1、藁城、新麦26、郑麦、济麦44、西农等品种，这些品种的研发主体主要为科研院所和大学。企业在分子育种方面的应用力度稍显不足。总体感觉我国小麦分子设计育种进展缓慢，多数建立在个别基因、个别性状的单一化分子育种阶段，资金投入严重不足，没有很好的把种质资源、规模化表型鉴定和资源的全基因组基因分型等大数据优势有机整合，仍然是以田间经验育种为主，分子辅助育种为辅的育种阶段。本所具备规模化基因分型平台、高密度已知品种SNP指纹及表型等大数据库，具备搭建分子设计育种平台的技术优势，诚挚欢迎各位有志于分子设计育种服务的老师合作和亲临指导！3.3做好标准研发，为种业做好技术支撑本团队主要从事小麦品种分子鉴定技术开发与利用研究，目前已经制定了小麦品种真实性、品种纯度等分子鉴定标准，特异性、一致性和稳定性等标准已经在区域试验领域应用10年有余，在此也希望本群全体老师对以前标准中存在的问题多提宝贵意见和建议，为后期品种分子鉴定标准的研发和完善献计献策。随着国际植物新品种保护公约1年文本的实施，实质派生品种（EDV）的分子鉴定也纳入快速制定轨道，对EDV品种分子鉴定大家有什么意见和建议欢迎提出指导意见。欢迎各位老师来北京小麦种子检测中心参观、指导、交流和合作！！！作者简介：庞斌双，女，博士，研究员，北京小麦种子检测中心主任。本科毕业于兰州大学生物系，硕博连读于中国农科院研究生院，7-年在甘肃省农科院粮食作物所从事春小麦远缘杂交育种，-在中国农科院作物科学所从事小麦品质相关功能基因组学研究，-至今在北京市农林科学院小麦所从事小麦品种鉴定技术开发与利用研究。主持项目（课题）16项，获奖1项，制定农业行业标准3项，出版著作2部，获得国家发明专利3项，获得软件著作权1项，发表论文20余篇。