文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
小麦是世界上栽培最早，也是最重要的粮食作物之一，在全世界的粮食总产量之中，小麦的产量居第一位，不但提供了最多的热量，而且提供了最多的蛋白质。
其所含的贮藏蛋白是影响小麦品质和面制品加工性能的重要因素，对小麦种子蛋白质性状的改良，构成了培育优质小麦品种的重要方面。
而滨麦属禾本科大麦亚族的一个异源四倍体野生种，对小麦条锈病等多种病害有良好抗性，具有耐盐碱、秸秆粗壮、大穗多花等优良性状，是改良小麦品种的优良种质资源之一。
滨麦HMW-GS基因的克隆与序列分析
滨麦是小麦亲缘种属，具有丰富的基因变异，对小麦条锈病等多种病害有良好抗性，同时具有耐盐碱，秸秆粗壮，大穗多花等优良性状，可以作为小麦品种改良的优良种质资源。
它的基因组总DNA的提取采用CTAB法，并用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳法检测，达到了一条整齐的基因组DNA条带，说明所提取的基因组DNA具有良好完整性。
经紫外分光光度计分析，所提取的DNAOD/OD比值在1.7-1.9之间，OD/OD比值高于2.0，说明提取的DNA纯度达到要求。
以提取的滨麦全基因组DNA作为模板，利用P3/P4引物组合进行PCR扩增，得到了一条bp左右的DNA扩增片段，回收将该DNA片段并测序，得知该扩增片段的序列长度为bp。
实验结果表明，HMW-GS基因编码的氨基酸序列一般包含一个信号区和3个结构域，即非重复N-末端区、C-末端区和一个高度重复的中部区。
x-型亚基在N-末端区和C-末端区分别有3个和1个半胱氨酸残基，但还没有发现有相邻的半胱氨酸残基。
滨麦HMW-GS基因编码的氨基酸序列是由信号肤、N-末端区、中部重复区以及C-末端区，分别由21、、、42个氨基酸残基组成。
基本符合y-型HMW-GS基因序列编码的多肤序列结构特点，说明该基因属于滨麦的y-型HMW-GS基因。
此外，得到序列长度为bp的滨麦HMW-GS基因序列，分析表明，该基因与簇毛麦纤毛鹅观草的y-型HMW-GS基因具有较近的同源关系。
滨麦HMW-GS基因的分离和对其结构分析,为对滨麦HMW-GS基因的结构以及功能的深入研究和对普通小麦的品质改良提供了参考依据，对改良小麦品质具有一定的指导作用。
而滨麦HMW-GS基因的成功分离和基因结构分析，对有效利用滨麦的有益基因、丰富小麦谷蛋白基因资源，促进小麦品质改良具有一定的指导意义。
滨麦LMW-GS基因的克隆与序列分析
小麦品质受低分子量谷蛋白亚基的影响很大，LMW-GS蛋自约占种子贮藏蛋白的1/3，占谷蛋白总量的60%，形成的聚合体与面筋强度有关，它的等位变异对面包小麦的面筋品质影响很大。
编码LMW-GS的基因无内含子，典型LMW-GS蛋白的结构一般包括域：信号肤区N端保守区、中部重复区和C端保守区4个主要的区。
根据其N端氨基酸的不同，可将LMW-GS分为LMW-m、LMW-s、LMW三种类型，其亚基对应的第一个氨基酸分别为:甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸。
通过对LMW-GS基因序列的比较发现，编码基因两端的核甘酸序列保守性相当高，这以特点为采用PCR扩增法分离克隆LMW-GS基因提供了可能性。
滨麦属禾本科大麦亚族赖草属的一个异源四倍体野生种，具有耐盐碱，秸秆粗壮，大穗多花，抗小麦多种真菌和细菌病害等优良性状，是小麦品种改良的优异种质资源之一。
利用引物组合LGP7/LGP8，以滨麦基因组DNA为模板，经PCR扩增和1%琼脂糖电泳检测，得到一条约bp左右的DNA片段将该DNA片段回收、克隆并测序，得到序列长度为bp的基因。
把该序列进行相似性比较，结果表明该序列与普通小麦、毛节麦、粗山羊草、钩刺山羊草、高大山羊草、华山新麦草等亲缘植物的LMW-GS基因序列，都具有很高的相似性。
将得到的滨麦LMW-GS基因序列进行氨基酸序列推导，序列HQ的起始密码子在碱基位置处，编码区完整，可编码的多肤氨基酸残基数为个，分子量为37.75KDa。
自起始密码子处开始，该序列包含的区段依次为信号肤区、N-末端区、中部重复区、C-末端I区、C-末端II区和5C-末端I区。
在中部重复区，多肤单元PFSQQQQ和PYPQQ重复次数较多，这条序列包含8个半胱氨酸残基，分别分布在四个区：中部重复区，C-末端I区，C-末端I区和C-末端I区。
其所含有的半胱氨酸个数分别为1个、5个、1个、1个，其中在C-末端I区的第4、5个半胱氨酸残基相邻。
而在N-末端区，其起始氨基酸序列为METSRIPG，因此，该序列为m-型LMW-GS基因。
典型LMW-GS的结构包括的主要区域一般有4个：信号区域，中部重复区，N端保守区和C端保守区。
通过对比17个已克隆的LMW-GS基因的氨基酸序列，构建了LMW-GS蛋白多肤结构的一般模式。
LMW-GS依次由信号肤，N-末端区，中部重复区，C-末端I区，C-末端II区和C-末端保守区组成，其中N-末端区和C-末端区非常保守。
在C-端非重复保守I区的第1、2个氨基酸残基I、P，也有人认为应该归到中间重复区。
利用引物对LGP7/LGP8经PCR扩增从滨麦基因组DNA中，获得了一个序列长度为bp的LMW-GS基因。
其编码区为bp，可编码个氨基酸残基，编码区具有典型的LMW-GS蛋白多结构的一般模式。
根据N-末端区氨基酸序列，可将低分子量谷蛋白其分为M、S和I型，其起始氨基酸分别为甲硫氨酸、丝氨酸和异亮氨酸。
而S型亚基占低分子量谷蛋白亚基的主要部分，它的N-末端区氨基酸序列以SHIPGL-开始。
I型的N-末端主要有IENSHIPG和ISQQQQ两种类型，M型则有3种METSHIPGL-、METSRVPGL-和METSCIPGL-，且以第一种居多。
在小麦低分子量谷蛋白基因中，半胱氨酸的数目和相对位置非常保守，一般LMW-GS都只含有8个保守的半胱氨酸，这对于分子内和分子间形成稳定的二硫键十分重要。
而稳定的分子内和分子间二硫键，有助于与多个蛋白质亚基的连接并使其形成网络结构，从而对小麦面粉的延展性和粘弹性产生影响。
滨麦醇溶蛋白基因的克隆与序列分析
麦醇溶蛋白是小麦胚乳的主要贮藏蛋白，研究表明，小麦面粉的烘烤品质受麦醇溶蛋白等位变异的影响很大。
对a-醇溶蛋白基因序列推导出的氨基酸分析的结果表明，其一级结构包括6个区域其中重复区和多聚谷氨酞胺区是不同基因的差异主要集中区。
保守的半胱氨酸残基分布在特征区，通过对a-醇溶蛋白基因序列的比较，发现其编码区两端核昔酸序列保守性极高，这就为采用PCR扩增法分离克隆醇溶蛋白基因提供了可能性。
利用引物组合CRP1/CRP2，从滨麦基因组DNA中经PCR扩增和1%琼脂糖电泳检测，得到一条约bp左右的DNA片段，将该片段回收、克隆并测序，得到序列长为bp的基因序列。
把该序列进行一致性比较，结果表明，该序列与华山新麦草的a-醇溶蛋白的基因序列相似性达到96%。
与澳冰草、拟鹅观草、长穗偃麦草、普通小麦、粗山羊草、一粒小麦、多年生簇毛麦和圆锥小麦等，小麦近源种属的α醇溶蛋白的相似性也很高，都在84%以上。
醇溶蛋白的N-末端序列共有三种，α/β-型、γ-型和ω-型，α和β型在结构上极为相似，而将醇溶蛋白分为a、γ和ω三类，大多数型醇溶蛋白在特征区有6个半胱氨酸残基。
一般认为，a醇溶蛋白氨基酸序列的一级结构包含6个区域，重复区由多干个重复单元组成，同时在氨基酸序列的结构上，很多分区方法不尽相同。
将氨基酸序列的前16个氨基酸残基归为信号肤：将N-端重复区的前5个氨基酸残基划为N-端区，而后是重复区。
实验得到的滨麦醇溶蛋白氨基酸序列的一级结构，与已知的-醇溶蛋白基因十分相似。
其氨基酸序列的一级结构依次是19个氨基酸组成的信号肤、88个氨基酸残基组成的富含谷氨酸和脯氨酸的N端重复区，重复单元主要是PQQPY和PQPQPFP，多聚谷氨胺I区和多聚谷氨胺区被特区I和特区I间隔。
该序列共有6个半胱氨酸残基，均分布于特征区，其中4个在特征区I，2个在特征区II，该结果为进一步研究滨麦a-醇溶蛋白基因的品质效应提供了一定的参考依据。
小麦种子贮藏蛋白是影响小麦品质和面制品加工性能的重要因素，小麦种子中贮存了大量的淀粉和蛋白质，对小麦种子蛋白质性状的改良，构成了培育优质小麦品种的重要方面。
由于麦谷蛋白亚基与小麦的面团粘弹性关系密切，因此具有优质亚基或着亚基组合的小麦品种品质特性大多比较优良。
向小麦背景中导入优质亚基基因可以通过传统育种和遗传转化等手段来实现，从而达到小麦品质的改良。
因此研究小麦近缘野生属植物种子贮藏蛋白基因的结构和功能，对促进小麦品质改良有着极其重要的意义。