γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）试剂盒说明书
微量法T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
GCL是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
测定原理：
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。
自备仪器和用品：
冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、浓硫酸和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加6mL蒸馏水充分震荡溶解。
试剂三：粉剂×1管，4℃保存。临用前加入蒸馏水1.5mL充分震荡溶解。
试剂四：液体7mL×1瓶，室温保存。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入12mL蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入μL浓硫酸（自备），边加边搅拌。
粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
细菌、真菌：按照细胞数量（个）：试剂一体积（mL）为~0：1的比例（建议万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
血清等液体：直接测定。
GCL测定操作：
分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到nm，蒸馏水调零。
空白管：取1.5mLEp管，依次加入试剂一48μL、试剂二52μL、试剂三12μL和蒸馏水24μL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15min；再加入试剂四60μL，混匀后，室温（25℃左右）g，离心10min，取上清μL，加入试剂五μL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定nm处光吸收，记为A空白管。
测定管：取1.5mLEp管，依次加入试剂一48μL、试剂二52μL、试剂三12μL和上清液24μL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15min；再加入试剂四60μL，混匀后，室温（25℃左右）g，离心10min，取上清μL，加入试剂五μL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定nm处光吸收，记为A测定管。
注意：空白管只需要测定一次。
GCL活性计算公式：
标准曲线：y=0.x，R2=0.
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1).按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min/mgprot）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=3.×（A测定管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。
GCL（μg/min/g鲜重）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=3.×（A测定管-A空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每个细胞每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min/cell）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=3.×（A测定管-A空白管）÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min/mL）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷V样÷T
=3.×（A测定管-A空白管）
0.：回归方程系数；V反总：反应总体积（mL）μL=0.mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，24μL=2.4×10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T：反应时间：15min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.x，R2=0.
（(1).按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min/mgprot）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=7.63×（A测定管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为为1个酶活单位。
GCL（μg/min/g鲜重）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T
=7.63×（A测定管-A空白管）÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每个细胞每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min/cell）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=7.63×（A测定管-A空白管）÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生1μg无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（μg/min/mL）=[（A测定管-A空白管）÷0.×V反总]÷V样÷T
=7.63×（A测定管-A空白管）
0.：回归方程系数；V反总：反应总体积（mL）μL=0.mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，24μL=2.4×10-2mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间：15min。
注意事项：
（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
（2）所有试剂配制完后，除表明4℃保存外，请于1天内用完。
（3）实验过程请带手套，试剂三中有强腐蚀性物质，注意不要溅到皮肤上或眼睛内。
（4）测定吸光值时请于水浴后10～40分钟内测完。
（5）样本测定前先取1-2个样做预实验，如吸光值太高，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内，哺乳动物组织和血液一般稀释3～5倍。
（6）试剂三配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。
（7）细胞中GCL活性测定时，细胞数目须在万-万之间，细胞中GCL的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处
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