从人类诱导多能干细胞（hiPSC）分化而成的心肌细胞在药物筛选和病理模型的构建中均表现出巨大潜力。然而，从体外实验转化为临床应用时，心肌细胞表型的不成熟降低了结果的可靠性。近日，约翰·霍普金斯大学JonathanH.Tsui等人在Biomaterials期刊发表了题为“Tunableelectroconductivedecellularizedextracellularmatrixhydrogelsforengineeringhumancardiacmicrophysiologicalsystems”的文章，开发了一种由脱细胞猪心肌细胞外基质（decellularizedExtracellularMatrix,dECM）与还原型氧化石墨烯（rGO）组成的一种杂化水凝胶（dECM-rGO），并通过实验证明该杂化水凝胶在构建工程化心肌组织与作为生物墨水进行3D打印中均有良好表现。
随着心血管疾病所带来的医疗负担逐年增加，大量研究致力于揭示其潜在的疾病病理和新药物开发。其中，体外构建的工程化心肌组织（EngineeredHeartTissues，EHTs）因其具有与体内相似的三维培养环境，而在前沿研究领域表现出很大优势。目前，已证明从人体诱导多能干细胞（hiPSC）诱导而来的心肌细胞（hiPSC-CMs）可组装至EHTs中。然而，hiPSC-CMs表型并不成熟，相比成体心肌细胞而言，其表达更相似于新生心肌细胞，从而在药物反应的表达中存在一定偏差。
一种策略是利用dECM体外重建心肌细胞外基质，进而诱导hiPSC-CMs的细胞成熟。dECM在很大程度上保留了其来源组织的生物化学组分。此外，研究发现合成材料中的高导电性材料如碳纳米管、石墨烯衍生物和金等对多种细胞类型（包括心肌细胞）的生长与成熟具有促进作用。基于此，本研究提出一种由dECM与rGO组成的杂化水凝胶。rGO在保证dECM生物活性的基础上，还能实现对水凝胶硬度与导电率的调节，从而在工程化心肌组织的构建中表现出更大优势。
1、dECM-rGO水凝胶的制备与表征
实验所使用的dECM-rGO水凝胶通过图1（a）所示方式制备。其中，通过改变NaBH4的浓度可得到不同还原程度的rGO。使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）对不同批次dECM的关键基质蛋白（Ⅰ-Ⅳ型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白）进行分析（图1（b）），虽然蛋白的含量在批次间存在差异，但总体含量与相对比例保持稳定（图1（c））。同时，这种dECM中的蛋白组成与在成年大鼠心脏所发现的蛋白组成相似，表明经过脱细胞处理的dECM在生化组成上仍保留着与发育阶段相一致的特异性。
使用扫描电子显微镜（SEM）观察dECM-rGO，发现其具有与天然脱细胞猪心肌组织类似的多孔网状结构（图1（d））。对孔壁进一步研究发现，沉积在壁上的rGO薄片平均直径为±79μm，表明封装的细胞能与其紧密的相互作用。但目前尚不清楚rGO的聚集是否会穿透孔壁，从而导致相邻孔隙之间的连接。
图1材料合成及结构表征
经过测试发现，随rGO还原程度与浓度的提高，dECM-rGO的压缩模量、粘度与导电率均会随之增加（图2）。其中，压缩模量的变化范围在10.6±0.3kPa到17.5±0.5kPa，与天然心肌的范围相当。且所有基于dECM的水凝胶都表现出了剪切变稀的特性。
图2dECM-rGO的力学性能与导电率
2、dECM-rGO心肌组织工程的收缩性能评估
使用hiPSC分化的心肌细胞与人骨髓基质细胞、预凝胶溶液制作三维工程化心肌组织（EHTs），通过柱的挠度变化测量收缩力（图3（a））。选择Ⅰ型胶原蛋白与谷氨酰胺转氨酶（TG）交联的dECM水凝胶（dECM-TG）作为实验的对照组，前者具有最接近于dECM的生化组成，后者与dECM-rGO（0.3%w/vmMNaBH4rGO）的硬度相似但无rGO引起的导电率提高。
将EHTs培养35天，每7天进行一次记录分析。结果表明：在整个培养过程中，dECM-rGO组织均表现出更大的收缩力，在第14天收缩力差距最大，在第28天与35天差距减弱（图3（b））。dECM-rGO组织收缩力达到峰值、减小90%的时间更短，从而表现出更大的收缩速度（图3（c）（d）（e））。同样，在第14天dECM-rGO组织与其他组织差距明显，在第35天基于dECM的组织表现差距不大。
由于观察到dECM-rGO组织对EHTs收缩性能的积极作用，对编码心肌收缩相关蛋白的基因表达进行分析，并以聚苯乙烯（TCPS）上培养的单层心肌细胞作为对照。β-肌球蛋白重链（β-MHC）与心肌肌钙蛋白（cTnT）与收缩力的调节有关，被认为是心脏发育晚期阶段的标志，其编码基因MYH7与TNNT2的表达在第35天显著升高，dECM-rGO组织在两个时间点的表达水平高于其他组织。TNNI3与TNNI1的表达比例表现出相同趋势（新生心肌细胞中主要表达TNNI1，成熟心肌细胞中仅表达TNNI3），这一趋势表明dECM-rGO组织促进了心肌细胞成熟，而这可能是使细胞收缩性能得到提高的重要因素（图3（f）（g）（h））。TTN与N2B:N2BA的表达增加对弹性模量与刚度的影响与收缩时间的减少密切相关（图3（i）（g））。
图3dECM-rGO心脏组织的收缩功能增强
为评估支架材料对肌节组织的影响，对EHTs切片并对α-肌动蛋白进行免疫染色（图4（a））。观察到心肌细胞沿组织轴向被拉长。此外，胶原组织中的肌节最短，随着水凝胶支架的硬度和导电性的提高，肌节逐渐延长（图4（b））。dECM-rGO组织中的肌节最长(2.11±0.02μm），与成人心肌细胞肌节的长度（约2.2μm）相似。肌节中的Z带宽度表现出相同趋势，证明dECM-rGO改善了心肌细胞的收缩性能。
图4心肌组织工程中肌节的发育
3、dECM-rGO心肌组织工程的电生理性能评估
对收缩期间细胞内Ca2+水平的变化进行检测（图5（a））。在第14天和第35天，dECM-rGO组织在收缩周期中具有更大的钙浓度(图5（b）)。检测钙离子通道的表达水平，CACNA1C和ATP2A2基因在dECM-rGO组织中的表达均显著升高，ATP2A2的表达在第35天进一步升高(图5（c）（d）)。
检测EHTs动作电位（图5（e）），使用复极化时动作电位持续时间的90%（ADP90）表示QT间期。在第14天，dECM-rGO组织的ADP90(±21ms)明显长于dECM组织(±11ms)，在第35天时差距不大。对影响动作电位平台期的K+通道表达进行检测，发现KCNH2(图5（g）)在dECM-rGO组织中表达上调近3倍，且两个时间点之间的表达没有显著变化。KCNJ2(图5（h）)的表达在以dECM为基础的水凝胶组织中没有显著差异，表达均随时间显著增加。这些K+通道表达水平的变化可以解释APD90中观察到的趋势：第14天时，dECM-rGO组织中KCNH2表达的显著上调可以解释其APD90的增加。随着时间的推移，第35天时，dECM组织中其他的K+通道表达(如KCNJ2)越来越多，APD90在不同组织中差异减小。
dECM-rGO组织还表现出更短的去极化时间与更快的电信号传导速度（图5（i~l））。即dECM-rGO使心肌细胞电生理性能增强，这种增强在短时间内差距显著。
图5dECM-rGO工程化心肌组织的电生理功能得到增强
4、dECM-rGO对转录因子表达的影响。
转录因子的表达在决定细胞生长和组织形态中起着重要的作用。在心脏前体细胞发育过程中，Nkx2.5和GATA4协同作用驱动心肌细胞分化。分析EHTs中NKX2.5和GATA4的表达发现，在第14天时，四种水凝胶支架中的表达水平均高于2D培养细胞，其中dECM-rGO组织中的表达水平明显高于对照(图6)。然而，随着EHTs逐渐成熟，两个基因的表达都显著下降。这种表达的下降与所使用的支架材料类型密切相关：随着微环境中诱因变得复杂，表达水平下降程度更大。这些结果说明了dECM-rGO促进转录因子的表达，从而促进细胞成熟。
图6转录因子随时间的表达
5、导电材料对心肌细胞膜电位的影响
将心肌细胞在具有石墨烯涂层玻璃基板上培养14天，与无涂层玻璃基板上的培养细胞对照，测量细胞的平均静息膜电位。在第7天时，两种基质上的细胞的膜电位相当；第14天时，石墨烯涂层玻片上的心肌细胞表现出更负的膜电位（图7），而膜电位的超极化不仅可以诱导细胞分化，还可以通过增加细胞内钙浓度和激活钙调神经磷酸酶信号来促进细胞的成熟。这一发现进一步表明了导电材料(如石墨烯)的促发育作用。
图7石墨烯诱导心肌细胞静息膜电位的极化。
6、dECM-rGO基质对粘着斑和ECM受体表达影响
对基于dECM和dECM-rGO组织的EHTs进行RNA测序与富集分析。与dECM组织相比，在dECM-rGO中表达增加4倍以上的基因大多控制ECM受体蛋白相互作用与粘着斑的形成。即dECM-rGO组织促进了心肌细胞电生理发育。
7、使用dECM-rGO作为生物墨水打印心脏组织进行心脏药物毒性测定
使用双喷头挤出生物3D打印机，以dECM和dECM-rGO作为生物墨水打印心脏组织（图7（a））。培养14天与35天时，使用西沙比利（cisapride）处理。西沙必利是一种组胺受体拮抗剂，常被用作hERG通道阻断剂，但会引起QT间期延长甚至造成致死性的尖端扭转型心室过速。传统的临床筛选试验中并未发现这种副作用。通过荧光成像评估西沙必利在一定浓度范围内对组织APD90与心律的影响。dECM和dECM-rGO组织对西沙必利浓度增加的反应显著不同(图8（b）)。虽然两种组织都表现出APD90延长和心律增加，但IC50值相差一个数量级(图8（c）)。dECM-rGO的IC50值与其有效血药浓度(ETPC)相似（2.6–4.9nM）。证明dECM-rGO能够改善工程化心肌组织表型，从而在药物筛选和疾病建模中产生有效数据；同时，在生物3D打印的适用性为高通量药物筛选平台的建立提供了可能。
图8生物打印心脏组织可以作为高通量药物筛选平台
文章报道了一种dECM-rGO新型杂化水凝胶。该材料通过促进转录因子表达、膜电位极化及电生理发育使工程化心肌组织的电生理特性与力学特性得到显著改善，同时证明这种改变符合临床生理表现。此外，杂化水凝胶特性的可调节性与作为3D打印生物墨水的适用性使其在模型构建与药物筛选中展现出更多潜能。
TsuiJH,LeonardA,CampND,etal.TunableElectroconductiveDecellularizedExtracellularMatrixHydrogelsforEngineeringHumanCardiacMicrophysiologicalSystems.Biomaterials,(1):.