编者按：最近连续收麦，众小编有点吃不消，趁着端午休整几天。就在这期间我们国家小麦抗病遗传研究上连续出现几个重要进展！令人振奋！今天，我们推送由中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇课题组和中国农业科学院作物科学研究所李洪杰课题组等单位合作克隆的两个小麦抗白粉病基因Pm5e和Pm41。具体内容如下，敬请赏析。
1.研究背景
小麦白粉病是广泛流行的真菌性病害，严重影响小麦的产量和品质。目前已经发现60多个抗白粉病基因(Pm)位点，其中只有Pm3、Pm38/Yr18/Lr34/Sr57、Pm8、Pm46/Yr46/Lr67/Sr55、Pm2、Pm60、Pm17、Pm21和Pm24先后被克隆。
我国小麦地方品种蕴含丰富的抗白粉病基因资源，目前只有Pm24被克隆（NatureCommun
刘志勇组与李洪杰组合作克隆小麦抗白粉病基因Pm24）。Pm5e(复壮30)位于Pm5位点，有Pm5a、Pm5b、Pm5c、Pm5d和Pm5e等多个复等位基因；泾惠30及其提纯复壮的复壮30（Pm5e载体）曾在-年间广泛种植于陕西关中平原和渭北塬，近80年来仍对我国80%的白粉菌菌株具有抗性(Xieetal.,)，表明Pm5e基因具有持久和广谱的抗性。
2.Pm5e精细定位
首先利用高感白粉病品种农大与复壮30构建的重组自交系进行了两轮BSR-Seq分析(图1)。分别选取农大×复壮30的RIL群体中60个纯合抗病和60个纯合感病的RIL家系构建了抗病混池和感病混池进行转录组测序，利用BSR-seq分析出的抗、感池间SNP/InDel开发分子标记，在3,个F2:3家系作图群体上进行精细作图，将抗白粉病基因Pm5e定位在分子标记WGGC和WGGC之间0.17cM遗传区间；再利用Pm5e两侧分子标记WGGC和WGGC从精细定位群体中筛选重组体，用15个纯合抗病和20个纯合感病重组家系再次构建抗、感混合池，进行第二次转录组测序，并继续开发分子标记，将Pm5e定位在分子标记WGGB2和WGGB3之间0.04cM遗传区间，对应中国春基因组13.5kb的物理区间。两轮BSR-Seq分析提升了定位区间作图的精度，直接鉴定出与目标基因相关联的基因组区段和序列变异。
图1两轮BSR-Seq进行基因定位示意图(Xieetal.,)
3.Pm5e的克隆
Pm5e定位区间在中国春参考基因组序列中注释出3个基因：Rx-cc-like基因RXL、具有NBS-LRR结构域基因NLR和具有C2结构域的基因C2。根据中国春序列分别在复壮30和农大中扩增包括这3个候选基因的13.5kb基因组序列，发现RXL和NLR基因呈“头对头”的位置关系，两个基因的ATG间隔bp。与感病品种农大相比，复壮30中的RXL基因外显子上存在一个A/G的同义SNP(分子标记WGGB2)、一个C/T的非同义SNP和一处7bp的缺失，缺失导致该基因编码框发生改变；复壮30中的NLR基因第一个外显子上存在一个C/T同义SNP，第三个外显子上存在A/G和C/T两个非同义SNP，第四个外显子上存在C/G和G/A两个非同义SNP；C2基因上不存在序列差异，仅在5-UTR区存在GA两个核苷酸的缺失(WGGB3)，且在抗病混池和感病混池RNA-Seq数据中未发现剪切方式和表达量的差异。与感病材料中国春相比，抗病亲本复壮30仅在NLR基因的第四个外显子上存在C/G和G/A两个非同义SNP，分别是c.CG和c.GA，RXL和C2基因不存在序列差异(图2)。由于Rx-cc-like和NBS-LRR类型的基因均与抗病性相关，因此将RXL和NLR都作为候选基因进行功能验证。
图2小麦抗白粉病基因Pm5e的图位克隆(Xieetal.,)
4.Pm5e候选基因的突变体验证
利用EMS处理复壮30种子创制突变体库，对2,个M2代家系幼苗人工接种白粉菌E20菌株进行筛选，发现了29个感病家系。通过扩增这些纯合感病突变体的13.5kb定位区间基因组序列，在C2基因上未检测到序列变异，有4个突变体在RXL基因上发生了非同义SNP突变，有5个突变体在NLR基因上发生了突变，其中Mu的突变导致氨基酸的改变；Mu的突变发生在第2个外显子和第2个内含子的交界处，导致剪切方式发生改变；Mu和Mu的突变导致翻译提前终止；Mu的突变为LRR结构域上15bp的缺失(图3)。另有20个突变体未检测到序列变异。这表明RXL和NLR基因的突变都可能导致复壮30白粉抗性的丧失。由于RXL和NLR是“头对头”的位置关系，所以两个基因可能互为启动子，无法判断RXL上的4个点突变是影响了自身的功能还是影响了NLR的功能。NLR基因的翻译提前终止、剪切方式改变、LRR结构域缺失等突变体表明NLR基因功能的丧失可能导致了复壮30白粉病抗性丧失，NLR更有可能是抗白粉病基因Pm5e。
图3Pm5e位点的突变体功能验证(Xieetal.,)
5.Pm5e候选基因的转基因验证
为了进一步验证RXL和NLR基因的抗白粉病功能，分别构建了NLR基因自身启动子驱动的基因组全长序列互补载体和玉米Ubiquitin启动子驱动全长CDS的过表达载体，以及RXL基因自身启动子驱动基因组全长序列的互补载体，利用农杆菌介导遗传转化高感白粉病的小麦品种Fielder，利用E20菌株接种T0代转基因植株和T1代家系，发现NLR基因的互补载体和过表达载体转基因阳性植株对白粉菌E20表现高抗，而RXL基因互补载体的阳性转基因家系都表现高感反应型(图4)，表明NLR基因是小麦抗白粉病基因Pm5e。
图4Pm5e位点的转基因功能验证(Xieetal.,)
6.Pm5e基因NLR的单倍型分析
感病品种中国春和抗病亲本复壮30相比，NLR基因仅在第4个外显子上存在2个非同义SNP(c.CG和c.GA)。为了进一步明确NLR基因这两个SNP与其抗白粉病功能的关系，利用覆盖这两个位点的标记WGGB对来自35个国家和地区的份小麦材料进行序列扩增。发现其中的份材料由于序列变异较大，用引物WGGB无法扩增(之后开发了一个可以成功扩增该类群的新标记WGGB)；在份扩增成功的材料中，序列比较发现该区域可分为3种单倍型，分别是HapGA、HapGG和HapCG，其中HapGA仅包括24份高抗白粉病的材料(图5)。
图5Pm5基因位点的单倍型变异(Xieetal.,)
这些HapGA单倍型材料中的NLR基因所在13.5kb基因组序列完全一致，说明HapGA单倍型所有材料均含有Pm5e等位基因，其中包括小白冬麦(Mlxbd)、红蜷芒(PmH)、蚂蚱麦(Mlmz)、唐麦4号(PmTm4)、游白兰(PmYBL)和白蚰蜒条(PmBYYT)等，这些材料的抗白粉病基因均位于Pm5位点或其相近位置。从来源上看，含有Pm5e的材料全部是我国西北关中平原及其周边地区的地方品种(表1)。
表1小麦抗白粉病基因Pm5的单倍型序列变异(Xieetal.,)
7.Pm5e基因的选择驯化与来源追溯
Pm5e(HapGA)在小麦种质资源中的比例很低，而且只分布在我国部分小麦地方品种及其衍生品种中，3种单倍型在种质资源中所占的比例HapCGHapGGHapGA。秦汉时期关中平原地区土地肥沃、灌溉条件优越，农业生产比较发达。小麦被引入我国之后，得以在这一地区大规模种植，当时温暖潮湿的气候条件(竺可桢)可能有利于白粉菌的繁殖，在白粉菌的选择压力下，Pm5位点主要的单倍型HapCG驯化出HapGG，之后HapGG单倍型在当地发生自然突变，产生了稀有变异HapGA，即Pm5e，而含有该单倍型的抗病小麦被当地农民收集和保存下来(图6)。
共线性和进化分析表明，Pm5基因组区域在普通小麦中国春的7A/7B/7D染色体、野生二粒小麦Zavitan的7A/7B染色体、粗山羊草AL8/78的7D染色体和大麦Morex的7H染色体存在良好的共线性关系，说明该基因组区段在小麦族里高度保守。NLR蛋白在粗山羊草和野生二粒小麦中的同源蛋白相似性较高，其次是大麦，在短柄草、水稻、乌拉尔图小麦、玉米、谷子、高粱中相似性很低，而且均位于非共线性的基因组区域，说明该基因可能产生于禾本科作物分化之后。
图6Pm5e在中国(a)和关中平原周边地区(b)的分布(Xieetal.,)
8.影响Pm5e基因功能的关键自然变异位点解析
为进一步了解Pm5位点在小麦品种资源中的序列变异，我们比较了Pm5e与其它等位基因之间的序列差异。与Pm5e相比，感白粉病的Pm5-BMDM属于HapGG-1类型，仅在第4个外显子上存在一个SNP(c.AG)，非常可能是Pm5e自然突变的供体类型；Pm5b(Misson)属于HapGG-2类型，在第3个内含子有一个SNP，在第4个外显子上存在SNP(c.AG)，在NB-ARC结构域有18bp的插入，在LRR结构域有33bp缺失，导致LRRmotif的数量减少。利用基因枪瞬时转化法证实了Pm5b具有抗白粉病功能(图7a)；我们发现Pm5d与Pm5e所在的13.5kb基因组区域序列完全一致，表明Pm5d与Pm5e是相同的等位基因，这与其均来源于陕西地方品种相一致；感病类型Pm5-CS属于HapCG-1类型，仅存在2个SNP；Pm5a(Hope)属于HapCG-2类型，在其编码的NLR蛋白N端有一个同义SNP，在第5个LRRmotif后面有一个非同义SNP，C端有2个非同义SNP；Pm5-ND属于HapCG-3类型，比HapCG-2类型在C端多了一个同义SNP；Pm5-AK58属于HapCG-4类型，一个13,bp的反转座子插入并替换了基因区bp的序列，这种类型可以用分子标记WGGB58检测(图5)。
等位变异和关联分析发现，位于Pm5e编码的NLR蛋白C端c.GA变异(对应氨基酸为p.MI)对Pm5e基因抗白粉病功能至关重要，该碱基的改变使高感白粉病的NLRG等位基因(Pm5-BMDM)突变为高抗NLRA等位基因(Pm5e)，对应的氨基酸由Met突变为Ile，增加了NLR蛋白C末端的疏水性，从而引起二级和三级结构差异。利用Phyre2网站预测了Pm5e蛋白和仅差一个氨基酸的Pm5-BMDM蛋白结构，发现两个预测蛋白在二级和三级结构上均存在差异，说明有可能是该氨基酸的变异导致抗病小体蛋白构象发生改变，使其在与病原菌效应因子识别时功能发生改变。
目前克隆到的小麦抗白粉病基因均为显性遗传，而含有Pm5e基因的小麦品种和地方品种的白粉病抗性多呈隐性遗传，或不完全显性遗传(小麦抗白粉病基因Pm5(一))。在人工接种白粉菌后，复壮30叶片上的菌丝数量和菌丝长度都显著低于农大，且可以观察到活性氧爆发，表明Pm5e可抑制白粉菌的侵染和生长；农大与复壮30的杂种F1植株叶片上菌丝数量和长度呈中间型，同样也可以观察到活性氧爆发，表现一定的抗性反应，说明Pm5e为部分显性基因，或不完全显性基因(图7b，7c)。同时，白粉病菌接种后，Pm5e受白粉菌诱导表达，在接种后6h表达量最高(图7d)，表达丰度一直高于感病品种农大，表明Pm5e的高表达可能与维持白粉病抗性有关。
图7Pm5b等位基因功能验证和Pm5e的表达模式(Xieetal.,)
9.Pm5e的利用价值
综上所述，Pm5e编码典型的NLR蛋白，该基因C端的稀有单核苷酸变异c.GA对白粉病抗性功能的获得至关重要，这种稀有等位变异仅存在于我国小麦种质中，尤其是以关中平原地区为核心的地方品种中。根据这一单核苷酸变异开发的KASP标记可以有效地区分小麦种质资源中的Pm5e单倍型(图8)，应用于分子标记辅助选择育种。Pm5e的克隆和稀有单核苷酸变异c.GA的发现为小麦抗白粉病分子设计育种和基因组编辑育种提供了宝贵的基因资源。
图8Pm5e位点的KASP标记检测(Xieetal.,)
小麦抗白粉病基因Pm5e(NLR)的克隆研究由中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇课题组、中国农业科学院作物科学研究所李洪杰课题组、美国USDA-ARS西部研究中心Yong-QiangGu课题组、河南科技学院、河南平顶山学院、中国农业大学、美国UCDavis和KansasStateUniversity等单位的研究人员合作完成。从胡铁柱年开始对唐麦4号中的抗白粉病基因进行分子标记定位，李静婷、谢菁忠、王丽丽、王勇和郭广昊等多位研究生同学先后参与了该项目的接力式研究，研究结果年6月22日在线发表于NewPhytologist杂志(Xieetal.,ietal.,)。
参考文献
1.竺可桢()中国近五千年来气候变迁的初步研究。中国科学16(2):-
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