食源性免疫活性肽的研究进展
——西北民族大学生命科学与工程学院
高丹丹教授
研究背景
食源性免疫活性肽无毒、低敏、安全性高且可以调节人和动物机体免疫能力，免疫活性肽在人类营养健康和疾病调节中发挥着不可替代的作用，它已逐步加入到新的功能性食品及临床治疗中。人们对免疫活性肽的研究始于年，Jolles等采用胰蛋白酶对乳蛋白进行水解得到免疫活性肽，并证明其具有提高巨噬细胞吞噬外来异物的能力，之后国内外的研究者发掘不同食物源蛋白质，酶解得到免疫活性肽，并对其结构及临床应用进行深入研究。我国学者王广先等将免疫活性肽应用到临床应用中，用于治疗肺癌，并取得显著效果。目前，国内外已将免疫活性肽应用到工业生产中，制备肽类药品及功能性食品。
食源性免疫活性肽的食源性蛋白质大多取自食品加工副产物，这不仅使加工副产物得到综合利用，创造更大的经济效益，还可降低了环境污染，其社会效益与经济效益并重。因此，高丹丹团队对食源性免疫活性肽的新技术体系与研究方法进行分析总结，这对掌握食源性免疫活性肽的研究现状、优势和不足，以及规划未来的研究方向具有指导意义。
1食源性免疫活性肽分类
1.1植物源免疫活性肽
1.1.1大米免疫活性肽
大米是我国主要的口粮，但大米附加值低，增值有限。以稻谷加工的副产物米糠为例，日本米糠的综合利用率达到%，同为发展中国家的印度也达到了30%，而我国米糠的综合利用率尚不足20%，资源浪费严重。所以有效利用加工副产物可以避免浪费资源，提高附加值。Takahashi等从大米胰蛋白酶水解物中分离出一个九肽，其氨基酸序列为Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg(oryzatensin)，并证明其具有增强巨噬细胞吞噬能力、促进肠道收缩和抗吗啡等免疫调节作用。卜汉萍采用碱性蛋白酶制备大米免疫活性肽，用x7型强阴离子交换树脂对大米免疫活性肽进行分离纯化，提高了大米免疫活性肽对巨噬细胞的增殖活性。王璐等通过胰蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶酶解分离纯化出的大米肽，能促进巨噬细胞RAW.7的增殖，其中，分子量~0Da的酶解肽具有最佳的促增殖效果。Xu等研究发现富硒大米蛋白酶解物可以增强RAW.7巨噬细胞吞噬能力，保护铅引起的免疫细胞毒性，证明大米活性肽对免疫细胞具有免疫保护作用。
1.1.2大豆免疫活性肽
年，美国就研制出大豆多肽产品，并建成了年产t食用蛋白肽的工厂，日本于20世纪8O年代开展此方面的研究并成功地将其应用于食品工业。我国于20世纪80年代后期也相继开展了对大豆多肽的研究。杨小军等研究发现，大豆蛋白酶解物有明显的刺激淋巴细胞转化作用，能显著促进大鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力﹑刺激胃肠道黏膜，提高肠腔分泌免疫球蛋白(sIgA)。余承高等研究发现高活性大豆肽可对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞﹑自然杀伤细胞(NKcell)活性有显著增强作用，证明大豆肽对机体具有免疫增强作用。左倩等通过对仔猪灌胃的实验，证实了大豆肽能提高肠黏膜免疫功能，上调免疫相关基因表达量，从而提高IgG和slIgA含量，增强仔猪免疫功能，更好促进仔猪的健康。
1.1.3小麦源免疫活性肽
年，有研究人员发现小麦谷蛋白的胃蛋白酶水解液中具有阿片活性的肽类物质，命名为面筋外啡肽，目前，对小麦免疫活性肽研究较多的仍然是阿片肽。张亚飞等通过体外淋巴细胞增殖法，检验小麦蛋白碱性蛋白酶水解物对免疫细胞的增殖作用，证明了小麦免疫活性肽的存在。代卉等采用碱性蛋白酶水解小麦蛋白，得到具有调节机体免疫功能的肽，研究发现其具有抗氧化活性，还可以增强脾细胞增殖能力和巨噬细胞的吞噬能力。此后，该课题组进一步采用小麦肽对受环磷酰胺免疫抑制小鼠进行灌胃，证明了小麦肽不仅可以恢复HC50和脾细胞增殖，显著提高抗体生成细胞含量和腹腔巨噬细胞吞噬能力，还可以增强小鼠血清清除DPPH?和清除?OH的能力。
1.1.4植物藻类免疫活性肽
海藻和微藻是具有光合作用的海洋生物，藻类食物本身就具有免疫调节功能，藻类水解物更是免疫活性肽的重要来源之一。Morrin等将经胰蛋白酶水解后的小球藻饲喂给营养不良的BALB/c小鼠，发现其先天性免疫和特异性免疫应答均增强，包括巨噬细胞吞噬能力、细胞介导免疫、依赖T淋巴细胞的抗体反应等。Cian等从一种红色海藻中酶解得到促肾上腺皮质激素释放激素(PCRH)，试验证明其可促进大鼠的脾淋巴细胞增殖，降低细胞抑制因子的产生，从而起到免疫调节作用。由于技术以及藻类本身具有免疫调节作用，目前我国对藻类免疫活性肽的研究较少，有待进一步发掘研究。
1.1.5其他植物来源的免疫活性肽
植物源免疫活性肽种类众多，除了上述大米、大豆及小麦等食源性免疫活性肽，还有玉米、水果及蔬菜等同样成为免疫活性肽的重要来源。玉米源免疫活性肽研究比较多，马子淇等用单因素及正交法证明胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解物，对小鼠T淋巴细胞增殖具有显著的促进作用，随后又研究了玉米黄粉免疫活性肽的最佳制备工艺，得出经胰蛋白酶水解提取，酶浓度3.0g/L，底物浓度60g/L，温度45℃，pH8.0，水解90min，并进一步证明大孔树脂脱盐纯化后的玉米黄粉免疫活性肽，具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的能力且有剂量依赖性。通过双层包埋法将其进行包埋制成微胶囊，提高其稳定性，便于日后人们使用及工业化生产。2年，许金光等用胰蛋白酶酶解软枣猕猴桃制备多肽并对其进行免疫试验，证明软枣猕猴桃多肽对小鼠机体免疫系统的免疫功能有增强作用。8年，王鹏等酶解榛仁蛋白得到分子质量小于3kDa的组分，并采用凝胶色谱及反相高效液相色谱对其进行分离纯化，得到了榛仁免疫活性肽序列:Pro-Glu-Asp-Glu-Phe-Arg(pedefr)，并证明其对细胞无毒性作用，且当浓度达到.0μmol/L时，可促进脾淋巴细胞增殖率达到44.21%，在伴刀豆蛋白A共同作用下，增殖率达到53.22%。除上述植物源活性肽外，还有学者从荞麦、花生等蛋白质中制备出免疫活性肽。
1.2动物源免疫活性肽
1.2.1乳蛋白免疫活性肽
Mercier等研究乳清蛋白及其酶解产物，证明乳清蛋白中含有免疫调节肽，表明构成免疫活性肽的氨基酸种类、数量和序列对其免疫活性有重要影响，强疏水作用能促使免疫活性肽与细胞膜相互作用从而增强其免疫活性。乳蛋白免疫活性肽，可以调节动物及人体免疫能力。早在年，乳蛋白免疫活性肽就已应用到临床试验，并取得显著效果。Hadden等用注射法将Tyr-Gly和Tyr-Gly-Gly两种乳蛋白免疫活性肽给93位艾滋病病人用，发现这两种肽能提高艾滋病人免疫能力，减缓艾滋病病情恶化，证明免疫活性肽对人体免疫功能具有增强作用。Miyauchi等报导了牛乳铁蛋白基因（LF）的胰蛋白酶水解物也具有免疫调节作用。徐鑫等用响应面法优化了胰蛋白酶酶解酪蛋白酸钠制备免疫肽的酶解条件，获得了酶解制备免疫活性肽的最优工艺。张奕等从发酵驼乳中提取出免疫活性肽，并证明其降低BALB/c小鼠脾淋巴细胞中核因子-кB和白细胞介素6的表达，同时明显升高γ-干扰素、白细胞介素12和白细胞介素23的表达，以此对细胞产生免疫调节作用。乳中蛋白含量丰富，乳蛋白是最富营养价值的蛋白质之一，也是含免疫活性肽最丰富的蛋白质。乳蛋白酶解是目前获得食源性免疫活性肽的主要来源，目前对其研究多在体外进行，应用于临床及在体内发挥功效的研究相对较少，有待深入探究。1.2.2鹿茸免疫活性肽
0版中国药典载，鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。姜红等确定了木瓜蛋白酶水解鹿茸血制备免疫活性肽的最佳酶解条件，酶解得到两条肽，通过体外活性试验，证明其中一条酶解产物能显著刺激脾淋巴细胞增殖，对?OH和DPPH?有较高的清除作用。张梦莹持续给予小鼠鹿茸乙醇提取物，发现能够一定程度上增强小鼠免疫力，证明了鹿茸乙醇提取物有良好的免疫调节作用。赵磊等通过酶解得到鹿茸蛋白肽，确定了肽的最佳酶解条件，发现了碱性蛋白酶酶解物VAWP-SGD在无诱导剂时，对小鼠脾细胞增殖有显著促进作用，其对ConA诱导的小鼠脾T细胞增殖促进作用最显著。
1.2.3水生动物免疫活性肽
赵毓梅等研究证明鲨鱼肝脏重量占内脏重量的70%，并具有很强的免疫活性。黄凤杰等研究结果显示，鲨肝活性肽S-能使环磷酰胺作用免疫抑制的小鼠的血清溶血素和PFC的形成增加，使其趋向正常，说明鲨肝活性肽S-能提高机体体液免疫应答能力。邓超等的研究表明，从霞水母中提取的胶原蛋白肽能提高吞噬细胞的吞噬活性，增强单核吞噬细胞系统的吞噬功能。证明胶原蛋白肽可使非特异性免疫功能增强。侯虎等也从阿拉斯加鳕鱼中分离出3种免疫活性肽，其氨基酸组成分别为：Asn-Gly-Met-Thr-Tyr，Asn-Gly-Leu-Ala-Pro和Trp-Thr，3种免疫活性肽均可显著促进脾细胞增殖、T细胞增殖及巨噬细胞吞噬能力。试验确定分子量和水解度是影响脾细胞增殖活性的重要因素，在水解度15%~18%时脾细胞增殖活性最高。李超柱等研究发现在一定浓度范围内，牡蛎蛋白活性肽对小鼠脾淋巴细胞增殖具有一定的免疫抑制作用，在未来医学器官移植方向应用前景广阔。Chalamaiah等研究发现南亚野鲮鱼卵蛋白的胰酶水解物可以增大BALB／c小鼠脾脏中的CD4+和CD8+T细胞的比值，增强免疫功能。其胃蛋白酶水解物可以增强巨噬细胞的吞噬能力。Kim等研究贻贝可食用部分酶解物发现，其可通过抑制MAPK和核因子кB通路来降低RAW.7巨噬细胞中一氧化氮、前列腺素E2、环氧酶(COX)-2等炎症因子的表达，改善细胞免疫活性，增强非特异性免疫作用。邓志程等酶解马氏珠母贝全脏器，分离得到两个肽，序列为Ala-Arg/Pro-Met和Val-Arg。并通过对小鼠淋巴细胞和腹腔巨噬细胞功能影响的测定，证明这两个活性肽段在低浓度（0.3mg/mL）时都表现出很高的体外免疫活性。
1.3微生物源免疫活性肽
梁奉军对8个小肽进行拼接，设计出具有免疫刺激活性的杂合肽，并分别在其C-末端和N-末端添加起始密码子ATG和酿酒酵母强终止密码子TAA，导入酿酒酵母，通过对照试验证明免疫增强型酵母可显著提高育苗的成活率，对白化病有很好的免疫增强作用。Morris等采用胰酶水解小球藻制备免疫活性肽，将其饲喂给BALB/c小鼠，发现小球藻免疫活性肽具有促进BALB/c小鼠骨髓细胞增殖、提高巨噬细胞吞噬能力等作用。食用免疫活性肽后的BALB/c小鼠先天性免疫和特异性免疫应答均增强。Cian等酶解一种红色海藻(柱叶帚霉)，酶解得到富含Asp、Ala和Glu的高水解蛋白酶解物，将其饲喂给大鼠，证明其可促进大鼠的脾淋巴细胞增殖，具有较好的免疫活性。
2食源性免疫活性肽制备方法
2.1微生物发酵法制备免疫活性肽
微生物发酵是利用微生物自身的胞外蛋白酶降解食源蛋白质的过程，微生物发酵工艺根据底物的不同分为液态发酵和固态发酵两种。李善仁等分别采用固态、液态发酵法利用混合菌种制备大豆肽，证明液态发酵时菌株发酵产酶水解更充分，更有利于降解豆粕蛋白。其使用发酵法制备活性肽的目的及优势在于，可以利用微生物降低或消除食品中存在的苦味。刘旺旺等以不同菌种液态发酵羊胎盘残留物制备活性肽进行研究比较，证明分子量大小对产物的生物活性有一定的影响，并对各组分进行免疫细胞增殖活性的研究，相同胎盘肽质量浓度（μg/mL）下，黑曲霉的免疫细胞增殖活性最高。
微生物发酵法使用时间较早且范围较广，发酵产物均匀且风味较好，微生物种类、数量及生产条件对发酵效果有至关重要的作用。但发酵工艺生产周期长，暂无统一固定工序流程，因此产品质量不稳定。
2.2酶水解法制备免疫活性肽
酶水解法制备免疫活性肽，是目前制备生物活性肽的主流方法，其操作条件温和、易控，需要控制合适的酶和确定所需的时间、底物浓度、温度、pH等条件，方便快捷、安全性高。酶解技术可控制酶切位点，控制制备肽的分子质量。常用的蛋白水解酶有三类：动物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶等；植物蛋白酶如木瓜蛋白酶及菠萝蛋白酶等；微生物蛋白酶如细菌胶原酶等。张锐昌等酶解小麦蛋白制备肽，采用响应面法优化胃蛋白酶酶解工艺条件，得出最佳条件为是温度为41℃、pH为2.0、底物浓度为3%、加酶量为U/g、酶解时间为7h。碱性蛋白酶的最佳酶解工艺是温度为70℃、pH为8.0、底物浓度为3%、加酶量为U/g、酶解时间为min。酶法制备肽适合生产小肽，其成本低，但蛋白酶的水解作用可能会产生许多副产物，而且缺乏合适的蛋白酶，产率较低。但是综合考虑成本、技术的成熟度等因素，酶法水解蛋白质生产活性肽具有较高的可行性。邓志程等通过模拟胃肠消化的方式对马氏珠母贝全脏器进行酶解，并利用人工神经网络对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶酶解阶段的工艺过程进行模拟优化，水解马氏珠母贝并分离纯化的两条二肽Ala-Arg、Val-Arg。它们显著提高小鼠淋巴细胞的转化能力和体液免疫的水平，并极显著地增强经抗原诱导的小鼠免疫应答能力。
3展望
很多食物源蛋白质是制备免疫活性肽的良好原料，食品加工生产的副产品和废料中蛋白质含量丰富，这样既节约了资源又保护了环境。目前，酶水解法制备免疫活性肽为最具有发展前景的免疫活性肽制备技术，一些问题已随着科学技术的发展得到解决和改善，例如利用复合酶解决单一酶酶解不完全的问题，但依然存在一定尚未能解决的问题，例如如何对蛋白肽键进行靶向性地酶解，仍是蛋白质酶解制备活性肽最难解决的核心技术。相对于酶解法而言，微生物发酵的过程中能够产生多种蛋白酶，微生物蛋白酶具有活性高、成本低的特点。植物原料发酵副产物可用作饲料，可有效避免浪费。所以此方法有待进一步深入研究。使用微生物发酵法，可用廉价的原料大量生产免疫活性肽，这将对畜牧业、粮食加工产业以及其他相关产业的发展产生深远的影响。此外，随着研究方法及科学技术的不断提高，未来将会有越来越多的动、植物及微生物源免疫活性肽被发掘并得到深入研究。此外，延长食源性免疫活性肽的保存时间、提高其稳定性以及利用现代生物技术预测以及制备、合成新的免疫活性肽也是极有价值的发展方向，而对免疫活性肽作用机理的探究及其安全性评价的摸索，更是今后需要深入研究的课题之一，只有在了解其调节机理和进行全面的安全评价后，免疫活性肽产品才能更好的用于实践，今后的研究空间将更加广阔。通信作者简介
高丹丹教授
西北民族大学生命科学与工程学院
高丹丹，女，南昌大学博士毕业，获得博士学位，西北民族大学教授，主要研究领域生物活性肽制备技术、天然产物功能性成分提取、乳酸菌分子生物学技术；担任《食品与营养科学》编委；《食品工业科技》杂志审稿专家；《现代食品科技杂志》审稿专家；《食品质量安全与检测学报》审稿专家；美泰科技（青岛）股份有限公司技术研发外聘专家。代表性论文：[1]DandanGao,PenghuiGuo,XinCao,LiliGe,HongxinMa,HaoCheng,YiqiangKe,ShienChen,GongtaoDing,RuofeiFeng,ZilinQiao,JialinBai,NurulI.Nordin,ZhongrenMa*().ImprovementofchickenplasmaproteinhydrolysateangiotensinI-convertingenzymeinhibitoryactivitybyoptimizingplasteinreaction，FoodScienceandNutrition,8:–.DOI:10.2/fsn3..
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