牛乳酪蛋白（casein，Cs）具有丰富的营养价值，且由于其疏水性低、净电荷高，在天然条件下及加工过程中均呈现出独特的展开结构，引起了人们研究它与花色苷、多酚、药物等物质相互作用的极大兴趣，并且有研究发现它们之间的相互作用会影响Cs的结构和功能性质。
沈阳农业大学食品学院的孔繁华、曹雪妍、岳喜庆*等人旨在利用多重光谱相结合的技术研究木糖醇（XY）与Cs的相互作用机制以及对Cs结构和功能特性的影响。拟采用荧光猝灭法研究XY对Cs的猝灭机制，判断二者之间是否存在相互作用，并计算二者的结合常数、结合位点、结合距离以及相关的热力学参数，探讨二者的相互作用机制；利用同步荧光光谱法研究XY主要结合的氨基酸残基；利用三维荧光光谱法研究XY对Cs中氨基酸残基微环境极性的影响，进而推测对Cs构象的影响；采用傅里叶变换红外光谱和圆二色谱法分析评价Cs二级结构及相对含量的变化，进一步验证XY与Cs相互作用的存在，此外还对复合物的乳化性和表面疏水性进行测定，从而为XY在乳制品中的添加及功能性乳基料的开发提供理论参考依据。
1、内源性荧光光谱分析
Cs自身含有3种生色基团——色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。当在nm波长激发时，普通具有荧光的蛋白质分别在、、nm波长处出现吸收峰，强度比约为Trp∶Tyr∶Phe＝∶9∶0.5。纯Cs溶液的最大发射波长（λmax）约在nm处，可以判断促使Cs发荧光的主要是Trp残基。
2、XY与Cs的猝灭效应
根据公式用F0/F对CQ作图，可以得到Cs与XY相互作用的Stern-Volmer曲线，根据图中的直线斜率可以计算出公式中的Ksv和Kq。F0/F与CQ呈现出良好的线性关系，说明在反应过程中只存在一种猝灭机制。3个温度下的Ksv值随着温度的升高而变小，符合静态猝灭的规律。而且XY对Cs猝灭的速率常数Kq大于生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0×L/（mol·s），因此，可以判断XY对Cs内在荧光猝灭效应的机制主要是通过与Cs形成新的复合物的静态猝灭。
3、结合常数（KA）及结合位点数（n）的计算
可以看出，XY与Cs之间至少存在一个结合位点。结合常数KA较大，数量级在左右，随着温度的升高，KA逐渐降低，表明在结合过程中生成的复合物Cs-XY不稳定，当温度升高时，复合物可能部分分解。KA和n的值都随着温度的升高而下降，与前文中Ksv的趋势一致，再次证明该过程的猝灭机制属于静态猝灭。
4、热力学参数与作用力
XY与Cs相互作用的过程中?G＜0，表明该结合过程是自发进行的；?H＜0，?S＞0，说明Cs与XY之间的相互作用属于放热反应，反应中的主要作用力为静电引力，但是考虑?S＞0，所以也不排除疏水性相互作用在其中起作用。
5、同步荧光光谱分析
随着XY用量的增加，Cs两个不同波长差的同步荧光光谱均明显降低，这与前人研究锦葵-3-O-葡萄苷对牛乳α-Cs和β-Cs同步荧光光谱影响的结果相似，表明Cs分子中的Tyr和Trp均由于XY的加入而被不同程度的猝灭，但相比之下，Trp的被猝灭程度要大于Tyr，由此可以判断XY主要结合在Cs的Trp残基上；此外，?λ为60nm的谱图表现出明显的蓝移现象，而?λ为15nm谱图的出峰位置几乎没有变化。
6、三维荧光光谱分析
从峰的强度来看，随着XY浓度的增加，两种峰都变的稀疏，说明加入XY后瑞利散射峰和荧光峰的强度均有不同程度的降低，说明色氨酸和酪氨酸残基附近的微环境发生了变化，进而可以推测XY与Cs间存在相互作用，且二者能够形成复合物，并改变Cs的微环境和构象，这与同步荧光的结果一致。
结论
通过利用荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、傅里叶红外光谱和圆二色谱的多光谱组合法探究XY对Cs光谱性质以及结构的影响，并测定了其乳化性和表面疏水性的变化，有助于更好地理解牛乳蛋白质和XY之间的结合过程中涉及的化学机理，为功能性乳基料的生产提供理论依据。具体得出以下结论：1）XY对Cs的荧光猝灭机制是静态猝灭，生成了Cs-XY复合物，结合常数较大，且随着温度的升高而降低，说明生成的复合物不稳定。二者至少存在一个结合位点，结合距离为3.56nm，结合过程是一个自发的放热反应，主要作用力是静电引力和疏水作用力。2）XY的结合位点更接近于色氨酸，使色氨酸周围的微环境变得更加疏水，从而引起Cs的结构发生部分变化，进一步说明Cs与XY发生了相互作用。3）傅里叶变换红外光谱和圆二色谱的结果表明，与XY相互作用后，Cs的α-螺旋结构相对含量从54.91%降至44.97%，其他组分的相对含量略有增加，结构更趋向于紧密状态，证明XY的存在确实会影响Cs的二级结构。4）在XY的作用下，随着XY浓度的增加，Cs的乳化活性降低，乳化稳定性增加，表面疏水性降低，证实了Cs的结构发生了变化。
本文《基于多重光谱技术的木糖醇与牛乳酪蛋白相互作用及对酪蛋白结构的影响》来源于《食品科学》年40卷16期75-82页，作者：孔繁华，曹雪妍，康世墨，李玮轩，关博元，李墨翰，杨梅，岳喜庆。DOI:10./spkx2---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅
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