●前言
年9月欧易/鹿明生物客户南方医科大学第二临床医学院王丽娟教授课题医院神经内科在FrontiersinMolecularNeuroscience期刊上发表题为“L-AsparaginaseExertsNeuroprotectiveEffectsinanSH-SY5Y-A53TModelofParkinsonsDiseasebyRegulatingGlutamineMetabolism”的研究成果。通过GC-MS靶向代谢组学研究方法，确定谷氨酰胺代谢为L-ASNase治疗帕金森病的靶点，探索了L-ASNase对帕金森病的神经保护作用和相关机制，认为L-ASNase可能有望成为治疗帕金森病的一种有效药物。
中文标题：L-天门冬酰胺酶通过调节谷氨酰胺代谢发挥对帕金森病细胞模型的神经保护作用
研究对象：SH-SY5Y-A53T细胞（模拟帕金森病细胞）
发表期刊：FrontiersinMolecularNeuroscience
影响因子：4.
发表时间：年9月30号
合作单位：南方医科大学第二临床医学院
运用欧易/鹿明生物技术：GC-MS靶向氨基酸代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）
●研究背景
帕金森氏病(PD)是世界上第二种常见的神经退行性疾病。α-突触核蛋白（α-Syn）是帕金森病的关键致病因子，由于α-Syn未被正确降解而聚集，将导致神经退化并患上帕金森病。
到目前为止，左旋多巴（一种多巴胺前体）治疗仍然是帕金森病的主要治疗方案，其副作用包括疗效降低、运动障碍和长期使用后的运动波动。目前的治疗方案对帕金森病的疗效有限，而且长期使用后会使药物敏感性降低。因此，寻找其他有效的帕金森病治疗靶点，开发新的帕金森病治疗策略已迫在眉睫。
L-天门冬酰胺酶(L-ASNase)能够催化细胞中天冬酰胺和谷氨酰胺的水解，激活细胞自噬，并诱导α-Syn的降解，可能能够成为治疗帕金森病的有效药物。然而，L-ASNase治疗帕金森病的疗效和相关机制尚不清楚。这项研究根据GC-MS靶向氨基酸代谢组学分析确定了谷氨酰胺代谢为L-ASNase治疗帕金森病的靶点，发现L-ASNase通过适度剥夺谷氨酰胺，发挥对帕金森病细胞模型的神经保护作用，确定了L-ASNase诱导神经保护的相关机制，提供了一种治疗帕金森病的有前景的药物策略。
●研究思路
点击图片查看大图
●研究方法
1.研究材料
作者从美国ATCC购买SH-SY5Y细胞系，通过慢病毒过表达α-Syn基因得到A53T突变体，该突变体可模拟病理性α-Syn聚集的帕金森病模型。作者研究不同时间、不同浓度的L-ASNase对SH-SY5Y-A53T细胞的影响。GC-MS靶向氨基酸代谢组学实验所用实验分组为SH-SY5Y细胞和经/未经L-ASNase处理的SH-SY5Y-A53T细胞。
2.组学分析
GC-MS靶向氨基酸代谢组学实验（由鹿明生物提供技术支持）
3.检测方法
（1）生理生化实验：MMP检测，ATP检测，细胞色素C检测，镜检，谷氨酰胺合成酶（GS）活性检测
（2）功能验证实验：TUNEL检测，荧光染色观察，Westernblot分析，ELISA检测
●研究结果
1.特定浓度/时间的L-ASNase可激活SH-SY5Y-A53T细胞模型中α-Syn的自噬降解
作者将不同浓度/时间的L-ASNase加入SH-SY5Y-A53T细胞模型中，通过WesternBlot分析α-Syn、LC3-II和p62三种蛋白的表达量的变化，发现L-ASNase处理后的SH-SY5Y-A53T细胞α-Syn和p62表达下降，LC3-II表达增加（图1），表明L-ASNase可激活α-Syn的自噬降解。同时，作者发现在6h时间点和0.8IU/ml的浓度下L-ASNase可显著降低α-Syn水平并诱导自噬（图2A,B,C）。
图1
L-ASNase处理前后的SH-SY5Y-A53T细胞部分蛋白表达量
为了进一步验证L-ASNase是否通过诱导细胞自噬来促进α-Syn的降解，作者加入氯喹（CQ）以阻断细胞自噬，通过Westernblot分析发现加入CQ后α-Syn含量恢复(图2E)，表明当CQ阻断细胞自噬后，L-ASNase诱导的α-Syn降解被抑制。
图2
L-ASNase对α-Syn自噬降解和细胞活力的影响
2.在SH-SY5Y-A53T细胞模型中，L-ASNase可改善细胞线粒体功能，减轻MPP+环境下的线粒体损伤
PD的发病机制被认为是基因-环境相互作用的结果，而A53Tα-Syn突变是一种常见的遗传变异，可增加细胞对MPP+的易感性，导致氧化应激和线粒体功能障碍。
在本研究中，作者检测了经MPP+处理后的SH-SY5Y-A53T细胞加入L-ASNase后的线粒体功能相关指标（MMP变化、ATP形成、细胞色素C释放）（图3），结果表明L-ASNase通过改善PD细胞模型的线粒体功能发挥神经保护作用。
图3
L-ASNase对受MPP+处理和未受MPP+处理的SH-SY5Y-A53TPD细胞模型线粒体功能的影响
3.L-ASNase处理减少MPP+诱导的SH-SY5Y-A53T模型线粒体途径中的细胞凋亡
作者通过荧光激活细胞分选技术分析细胞凋亡，发现L-ASNase预处理可降低MPP+诱导的SH-SY5Y-A53T细胞凋亡率。此外，作者进行了TUNEL检测细胞凋亡，并通过电子显微镜检测了裂解的caspase-3(图4B)，进一步验证了L-ASNase对MPP+诱导SH-SY5Y-A53T细胞凋亡的保护作用。结果表明L-ASNase预处理降低了TUNEL阳性细胞（图4D）和裂解caspase3阳性细胞的百分率（图4E），进一步证实了L-ASNase的保护作用。
作者通过Westernblot分析检测了线粒体凋亡通路的部分指标的蛋白表达量（Bax、bcl2、caspase-9、caspase-3）（图4F-K），发现L-ASNase的神经保护作用与抑制PD模型线粒体途径的细胞凋亡有关。
图4
L-ASNase对MPP+诱导的SH-SY5Y-A53T细胞的线粒体途径凋亡的影响
4.在MPP+暴露的SH-SY5Y-A53T模型中，CQ可显著恢复L-ASNase减少的细胞凋亡
为全面研究L-ASNase诱导PD细胞模型凋亡减少与L-ASNase诱导自噬的关系，作者采用CQ从而阻断自噬，并通过荧光激活细胞分选和TUNEL/裂解caspase3染色分析细胞凋亡（图5A,B）。作者发现用L-ASNase和CQ共同处理SH-SY5Y-A53T细胞与L-ASNase单独处理细胞相比，MPP+诱导的细胞凋亡明显增加（图5C-E）。作者还通过WesternBlot分析检测了bax、bcl2、caspase-9/裂解caspase-9和caspase-3/裂解caspase-3的表达，发现L-ASNase减少SH-SY5Y-A53T细胞凋亡在一定程度上是通过自噬介导的。
图5
CQ增加了L-ASNase对MPP诱导的SH-SY5Y-A53T模型细胞凋亡的作用
5.GC-MS靶向氨基酸代谢组学分析L-ASNase对SH-SY5Y-A53T细胞氨基酸水平的影响
作者通过上述实验，发现L-ASNase可以调节氨基酸代谢，对PD模型有保护作用。为了进一步确定相关机制，作者通过GC-MS靶向氨基酸代谢组学分析对照细胞模型（SH-SY5Y细胞）和经/未经L-ASNase处理的PD细胞模型（SH-SY5Y-A53T细胞）内的氨基酸水平，检测到18种人体必需氨基酸。作者通过热图分析，发现各组间谷氨酰胺代谢差异最显著（图6A）。
为了进一步验证，作者用ELISA试剂盒对谷氨酰胺进行了定量测定，与对照组细胞相比，未经L-ASNase处理的PD细胞模型中谷氨酰胺显著升高，经L-ASNase处理后，高水平的谷氨酰胺显著降低（图6B）。
综上所述，这些结果表明谷氨酰胺代谢是L-ASNase治疗帕金森病的潜在靶点。
图6
GC-MS靶向氨基酸代谢组学分析对照细胞模型和经/未经L-ASNase处理的帕金森病细胞模型
6.补充谷氨酰胺降低了L-ASNase对SH-SY5Y-A53T细胞的神经保护作用
作者通过研究L-ASNase和谷氨酰胺对MMP，细胞活力和细胞凋亡的影响（图7A,C），发现加入谷氨酰胺可抑制L-ASNase对MMP的改善（图7C）、抑制细胞活力的提高（图7D）和抑制细胞凋亡的减少（图7E）。
图7
补充谷氨酰胺对L-ASNase诱导的神经保护作用的影响
7.补充谷氨酰胺可降低L-ASNase诱导的SH-SY5Y-A53T细胞模型中α-Syn的自噬降解和线粒体融合
作者进一步研究了L-ASNase对α-Syn自噬降解、线粒体融合的影响，以及谷氨酰胺在这一过程中的作用。作者通过WesternBlot分析，发现SH-SY5Y-A53T细胞经L-ASNase处理后，α-Syn和p62蛋白水平降低，LC3-II蛋白水平升高，但同时加入谷氨酰胺后，α-Syn和p62蛋白水平升高，LC3-II蛋白水平降低（图8D），表明补充谷氨酰胺可降低L-ASNase诱导的SH-SY5Y-A53T细胞模型中α-Syn的自噬降解。
作者通过研究SH-SY5Y-A53T细胞的线粒体动力学（图8E,F），发现补充谷氨酰胺可以抑制L-ASNase诱导的SH-SY5Y-A53T细胞线粒体的融合。
图8
补充谷氨酰胺对L-ASNase诱导的SH-SY5Y-A53T细胞中α-Syn自噬降解和线粒体融合的影响
L-ASNase通过调节谷氨酰胺代谢在PD细胞模型中发挥神经保护作用的原理模型（图9）。L-ASNase在诱导α-Syn自噬降解时，可引起适当的谷氨酰胺剥夺，导致自噬激活和线粒体直接或间接融合，从而改善线粒体功能，发挥神经保护作用。
图9
L-ASNase治疗帕金森病的相关机制
●研究结论
这项研究探讨了L-ASNase对帕金森病细胞模型的潜在作用，可以通过激活细胞中α-Syn的自噬降解和细胞线粒体的融合来发挥神经保护作用，首次证明了L-ASNase对帕金森病细胞模型具有神经保护作用。通过氨基酸靶向代谢组学研究了帕金森病细胞模型中的氨基酸代谢，发现谷氨酰胺代谢是L-ASNase治疗帕金森病的潜在靶点，确定了L-ASNase诱导神经保护的机制，为帕金森病的治疗提供了一种有前景的策略。
小鹿推荐
本研究通过GC-MS靶向氨基酸代谢组学分析发现了帕金森病细胞模型中的氨基酸代谢异常，证明了L-ASNase通过谷氨酰胺代谢对帕金森病细胞发挥作用，发现了L-ASNase治疗帕金森病的潜在靶点，确定了L-ASNase诱导帕金森病细胞神经保护的相关机制。这项基于靶向代谢组学的研究为帕金森病的治疗提供了一种有前景的策略。
文末看点
上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析团队。
相关更多疾病文章查阅，请戳~
◆项目文章
惊呆！慢性牙龈卟啉单胞菌感染（牙周炎）会增加癌症风险！
◆项目文章
TMT定量蛋白组学助力甘肃农大甜瓜的防御机制研究
◆收藏！一文读懂代谢物检测衍生化的重要性~
◆代谢细胞样本收集2步走，冲击高分文章有望啦！
欢迎百度搜索鹿明生物——访问鹿明生物